分享一篇2023年發(fā)表在Nature Communications上的文章，題目是“Two-photon fluorescence imaging and specifically biosensing of norepinephrine on a 100-ms timescale”。文章的通訊作者為華東師范大學化學與分子工程學院化學系田陽教授。
神經(jīng)遞質(zhì)在維持生理過程方面起著至關(guān)重要的作用，例如調(diào)節(jié)新陳代謝，參與神經(jīng)調(diào)控和影響器官功能。特別是，當神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前膜釋放，通過突觸擴散到鄰近神經(jīng)元，并與突觸后神經(jīng)元膜上的受體結(jié)合時，神經(jīng)元之間的信號傳導(dǎo)就會發(fā)生。例如，多巴胺（DA），腎上腺素（EP）和去甲腎上腺素（NE）是一類基于兒茶酚胺的結(jié)構(gòu)相似且可相互轉(zhuǎn)化的神經(jīng)遞質(zhì)，其中NE在其相互轉(zhuǎn)化過程中處于中心位置。因此，NE被認為是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)之一，去甲腎上腺素能傳遞的功能障礙與一系列神經(jīng)退行性和精神疾病密切相關(guān)，包括帕金森病（PD）、阿爾茨海默病（AD）、抑郁癥等。盡管它在各種生理和病理生理過程中的重要性得到公認，但以高靈敏度和高時空分辨率監(jiān)測生命系統(tǒng)中的瞬態(tài)NE動力學仍然是一個艱巨的挑戰(zhàn)。
在此，設(shè)計并合成了一種新型小分子熒光探針（BPS3，圖?1），帶有兩個由烷基鏈連接的苯基吡啶，不僅保證了良好的水溶性和靈活的分子構(gòu)象，而且還表現(xiàn)出優(yōu)異的細胞膜靶向性。?此外，引入末端S-對甲苯硫代碳酸酯作為NE的觸發(fā)基團，可以進行順序親核取代，然后分別與NE的特征伯氨基和β-羥基發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，實現(xiàn)了優(yōu)異的選擇性?向?NE?而不是其他兩種兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)（EP?和?AD）。
在添加NE的情況下，在緩沖溶液中對探針BPS3進行熒光滴定實驗。?如圖?2a?所示，隨著?NE?的逐漸加入，探針在?480nm?處的熒光強度相應(yīng)降低，幾乎達到加入?300nM NE?時的最小值（約初始值的?23%）。?圖?2b?繪制了熒光強度變化率（ΔF/F0）與?NE?濃度的關(guān)系圖，在?0-200nM?的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性，檢測限評估為?0.5nM（3σ/S，其中?σ為探針樣品的標準偏差（S.D.），n?=?20，S為校準曲線的斜率）。值得注意的是，即使對于通常與?NE?無法區(qū)分的兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，即?DA?和?EP，它們的干擾也可以忽略不計（與目標分析物?NE?相比，DA?為?4.1%，EP?為?8.6%，圖?2c），?驗證了?BPS3?對?NE?的卓越選擇性。
圖3a顯示了5 μM探針BPS3在水溶液中與100 nMNE反應(yīng)獲得的動力學數(shù)據(jù)，其中探針在480 nm處的熒光強度在與NE混合后立即降低，并在100 ms內(nèi)達到平臺（綠色曲線）。如圖?3b?所示，在來自硼苯基的質(zhì)子?H1,2?和來自硫代碳酸酯苯基部分的質(zhì)子H11,13?之間發(fā)現(xiàn)了一對?NOE?信號，證實了兩個末端基團的空間接近性，這是折疊的典型特征?構(gòu)象。?此外，對探針BPS3不同構(gòu)象的理論計算也證實，折疊構(gòu)象比拉伸或準正交構(gòu)象具有相對較低的能量。?折疊構(gòu)象的更高穩(wěn)定性可以通過基于?Hirshfeld?分區(qū)?(IGMH)?分析的獨立梯度模型進一步合理化（圖?3c），它顯示出明顯的范德瓦爾斯相互作用和苯環(huán)之間的?π-π?堆積效應(yīng)（綠色層狀）?在拉伸結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)的區(qū)域）。?此外，與拉伸構(gòu)象相比，BPS3的硫代碳在折疊構(gòu)象中具有更大的Hirshfeld電荷值（圖3d），表明其具有更強的親電性，更有利于親核取代反應(yīng)。
如上所述，探針BPS3可以在100 ms內(nèi)完成水溶液中NE的檢測。然而，如果通過與二甲基甲酰胺（DMF）混合將系統(tǒng)中的水餾分降低到50%，則需要大約120秒才能完成與NE的反應(yīng)（圖4a，紫色曲線）。為簡潔起見，將水中涉及BPS3-F的反應(yīng)途徑稱為路徑1，將涉及BPS3-S的反應(yīng)途徑稱為路徑2。如圖（圖4b），過渡態(tài)的理論研究表明存在漸進和級聯(lián)的親核取代-環(huán)化途徑。在兩條路徑（路徑?1?和路徑?2）中，在水性環(huán)境中觀察到涉及?BPS3、NE?片段和水分子之間各向異性氫鍵的反應(yīng)坐標，其中活性水分子充當質(zhì)子轉(zhuǎn)移的分子橋?通過分子間六元環(huán)過渡態(tài)的形成（路徑?1?中的狀態(tài)?TS6?和路徑?2?中的狀態(tài)?TS3，在圖?4c?中）。
如圖?5a?所示，BPS3?和?DiI?的兩個發(fā)射通道的熒光分布重疊良好，Pearson?相關(guān)系數(shù)高達?0.93，表明其在神經(jīng)元細胞膜靶向方面具有出色的能力。如圖?5b?所示，最初，兩組神經(jīng)元在神經(jīng)元細胞膜處均表現(xiàn)出強烈的熒光發(fā)射。然而，當一組僅用PBS緩沖液處理，而另一組用高濃度鉀處理時，兩組的熒光強度差異很大，即前者的熒光強度幾乎保持不變，而后者的熒光強度變化很大?在?2s?內(nèi)顯著增加，表明該組神經(jīng)元細胞膜上的?NE?快速增加（圖?5c）。細胞內(nèi)鈣濃度的增加進一步導(dǎo)致含有?NE?的囊泡遷移和融合到細胞膜，在那里它們最終被胞吐到突觸間隙中（圖?5d）
綜上所述，本文開發(fā)了一種新型雙光子激發(fā)小分子熒光探針?BPS3，它能夠在單個活神經(jīng)元水平上實時監(jiān)測和成像去甲腎上腺素，具有高選擇性和靈敏度，源自特定的順序親核取代環(huán)化觸發(fā)?反應(yīng)。?更重要的是，這種開發(fā)的探針可以精確靶向神經(jīng)元細胞膜，細胞膜是突觸的前沿細胞器，直接參與神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和攝取，在神經(jīng)信號的傳遞中起著極其重要的作用。?該探針最顯著的特點是令人印象深刻的高時間分辨率，可以在?100ms?內(nèi)響應(yīng)?NE，這是迄今為止報道的?NE?小分子熒光探針中檢測速度最快的。?基于綜合實驗和理論分析，揭示了一種獨特的雙重加速機制，即分子構(gòu)象折疊和水橋接，顯著降低了探針與NE之間反應(yīng)的活化能，從而提高了反應(yīng)速率更多?分別是?105?倍和?103?倍。?得益于探針出色的時空分辨率，成功地將其應(yīng)用于神經(jīng)元?NE?反應(yīng)及其在高鉀刺激下的動態(tài)成像，首次在秒級時間尺度上捕捉到神經(jīng)元細胞膜上?NE?濃度的快速升高?小分子熒光探針。?更重要的是，腦組織切片的影像學研究進一步顯示?AD?小鼠的?NE?水平下調(diào)，這可能是由于?AD?病理下神經(jīng)元的去甲腎上腺素能功能受損。?此處展示的結(jié)果不僅為?NE?檢測提供了一種優(yōu)越的分子成像工具，有利于高級神經(jīng)科學研究，而且還揭示了雙重加速機制，可能進一步為生物、分析、有機和物理化學家在研究中帶來新的靈感。?超快檢測和反應(yīng)動力學規(guī)定。
