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分享一篇發(fā)表在Nature上的文章，文章的題目是“Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C?H bond functionalization”，通訊作者是美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）的唐奕教授和Masao Ohashi。他們的主要研究方向是天然產(chǎn)物生物合成和酶催化機(jī)制。

碳?xì)洌–-H）鍵的鹵化是一種非常有用的官能化反應(yīng)，雖然多種合成方法可以引入鹵原子，但控制鹵化的區(qū)域和立體選擇性仍是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，金屬酶催化?C-H 鍵的鹵化成為控制選擇性的一種有吸引力的策略。雖然依賴flavin的鹵化酶可用于催化多種底物的sp2 C-H鍵鹵化，但對(duì)sp3 C-H鍵的酶法鹵化仍很有限。迄今，非血紅素鐵/α-酮戊二酸依賴性鹵化酶（non-haem iron/α-ketoglutarate-dependent halogenase，NHFeHal）是唯一一個(gè)催化未活化的C（sp3）-H鍵鹵化的酶家族。作者在此報(bào)告了一種之前未知的銅依賴鹵化酶ApnU的發(fā)現(xiàn)和表征，其可實(shí)現(xiàn)前所未有的酶促C(sp3)-H鍵官能化，如碘化和硫氰酸化。

作者將目光聚焦于一個(gè)廣泛存在于真菌天然產(chǎn)物的生物合成途徑中的酶家族DUF3328，之前僅有文獻(xiàn)表明其參與C（sp3）-H氧化官能化。作者通過(guò)基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該家族的一個(gè)成員ApnU的催化底物非活潑C（sp3）-H氯化的活性。ApnU含有兩個(gè)在DUF3328 蛋白家族中保守的 HXXHC 基序。四個(gè)組氨酸側(cè)鏈形成了一個(gè)平面的四個(gè)角，兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈位于平面下方。這種潛在的金屬配位環(huán)境與NHFeHals中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境截然不同。

作者在大腸桿菌BL21(DE3)包涵體中獲得表達(dá)的截短ApnU，并使蛋白重新折疊，得到了可溶的ApnU（NΔ75）。為了檢測(cè) ApnU 的活性，將重折疊的apo蛋白與抗壞血酸、各種還原劑和二價(jià)過(guò)渡金屬孵育。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有在Cu(II)存在的情況下才能實(shí)現(xiàn)底物的氯化，且催化需要氧氣和抗壞血酸。與NHFeHal催化的鹵化不同，在ApnU催化的反應(yīng)中，副產(chǎn)物主要是去飽和而不是羥化，表明由于金屬的不同，催促反應(yīng)可能存在關(guān)鍵的機(jī)理差異。

作者接著嘗試拓展了ApnU催化官能化的適用范圍，發(fā)現(xiàn)氯離子可更換為Br-、N3-和NO2-，反應(yīng)也能發(fā)生。有趣的是還觀察到了鐵基鹵化酶中無(wú)法實(shí)現(xiàn)的碘化、硫氰酸化和硒氰酸化。而氟化物（F-）、氰化物（CN-）、氰酸鹽（OCN-）、甲酸鹽（HCOO-）、硝酸鹽（NO3-）或甲硫酸鹽（CH3S-）均未觀察到相應(yīng)產(chǎn)物。

作者發(fā)現(xiàn)，在ApnU重折疊過(guò)程中加入GSH/GSSG氧化還原對(duì)是ApnU有功能的關(guān)鍵，提示了半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)至關(guān)重要。利用LC-(QTOF)-MS分析純化得到的ApnU活性組分表明，活性ApnU發(fā)生了同源二聚。因此作者使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法確定了活性ApnU的二硫鍵的正確連接位置，并使用AlphaFold2和Rosetta預(yù)測(cè)了二聚體的結(jié)構(gòu)。由于兩個(gè)HXXHC基序中的C173和C200是二硫鍵連接的，因此不參與金屬配位。作者隨后使用殘基突變、ICP-MS等確定了銅的配位環(huán)境和化學(xué)計(jì)量（雙核銅中心），并進(jìn)一步通過(guò)EPR實(shí)驗(yàn)和計(jì)算化學(xué)手段提出了反應(yīng)機(jī)理。

總的來(lái)說(shuō)，作者發(fā)現(xiàn)了一種以前未知的鹵化酶ApnU，其含有在DUF3328家族中保守的雙HXXHC基序，可能與兩個(gè)Cu(II)金屬離子形成金屬結(jié)合位點(diǎn)。該酶實(shí)現(xiàn)了前所未有的C（sp3）-H官能化，并為探索龐大的DUF3328金屬酶家族功能提供了藍(lán)圖。

本文作者：ZZX

責(zé)任編輯：MB

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08362-4

原文引用：DOI: 10.1038/s41586-024-08362-4

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