介紹一篇發(fā)表在Nature Methods上的文章“Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging”，通訊作者是來(lái)自韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)的Young-Tae Chang，韓國(guó)順天大學(xué)的Sung Ho Ryu，Hyung-Ho Ha和Do-Hyeon Kim。
熒光活細(xì)胞成像已成為研究蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)分子活動(dòng)不可或缺的工具，尤其是單粒子跟蹤（single-particle tracking, SPT）技術(shù)，可以直接可視化工作中的蛋白質(zhì)分子，提供它們?cè)?span id="zpklv0k" class="">單分子水平上動(dòng)態(tài)相互作用的時(shí)空信息。然而，目前活細(xì)胞單分子成像主要局限于短期時(shí)間尺度（低于幾十秒），這主要是由于熒光染料的光漂白，即熒光染料在激光照射下熒光信號(hào)逐漸淬滅。為解決這一問(wèn)題，研究人員不斷嘗試開(kāi)發(fā)光穩(wěn)定的熒光染料以實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定和長(zhǎng)久的蛋白質(zhì)分子動(dòng)態(tài)成像。在本文中，作者開(kāi)發(fā)了新型有機(jī)染料PF555，在活細(xì)胞成像中的光漂白壽命比以前已知的光穩(wěn)定染料長(zhǎng)一個(gè)數(shù)量級(jí)，為生理?xiàng)l件下單分子水平的長(zhǎng)期活細(xì)胞成像提供了強(qiáng)大的工具。
作者開(kāi)發(fā)新染料的思路來(lái)源于近期發(fā)現(xiàn)的一種有機(jī)染料光藍(lán)化現(xiàn)象，在激光激發(fā)下，大部分染料被漂白，但有一小部分染料會(huì)轉(zhuǎn)化為具有藍(lán)移激發(fā)和發(fā)射光譜的物質(zhì)。作者先在細(xì)胞中表達(dá)了N端Halo標(biāo)簽偶聯(lián)的EGFR，并用氯烷偶聯(lián)AF647（CA(O2)-AF647）標(biāo)記；隨后用642 nm激光照射標(biāo)記的細(xì)胞，直到AF647在遠(yuǎn)紅色通道（654-870 nm）中完全光漂白，并產(chǎn)生由561 nm激光激發(fā)，572-624 nm范圍發(fā)射的藍(lán)移新生熒光。出乎意料的是，在光藍(lán)物種中，作者觀察到一種超光穩(wěn)定的化合物。
為了純化這種光穩(wěn)定物質(zhì)并闡明化學(xué)結(jié)構(gòu)，作者合成了大量的TSCy5 作為 AF647 的簡(jiǎn)化相似化合物進(jìn)行體外合成和純化，作者在自搭建裝置中使用了高激光功率和恒定的氧氣補(bǔ)充，并純化出高效液相色譜中的兩個(gè)候選峰，并表征確認(rèn)后一個(gè)峰（保留時(shí)間20.05 分鐘，產(chǎn)量0.007%）是新的超級(jí)光穩(wěn)定物種，其激發(fā)和發(fā)射峰值分別為555 nm和567 nm，作者將其命名為PF555（Phoenix Fluor 555）。
接下來(lái)，作者將氯烷烴 （chloroalkane, CA）基團(tuán)引入 PF555生成CA（O2）-PF555來(lái)標(biāo)記Halo標(biāo)簽融合蛋白。顯微鏡下，PF555的光漂白壽命為314.4 秒，遠(yuǎn)高于已有的光穩(wěn)定染料，且在使用時(shí)不需要添加光漂白的拮抗劑。作者隨后用PF555觀測(cè)EGFR內(nèi)吞和再循環(huán)過(guò)程，該過(guò)程持續(xù)了近1小時(shí)，可以看到相比于對(duì)照條件下EGFR的穩(wěn)定信號(hào)，添加EGF后可以看到EGFR信號(hào)減弱發(fā)生內(nèi)吞，并在EGF被洗滌后信號(hào)重新逐漸復(fù)原恢復(fù)到細(xì)胞表面。最后，作者還用該熒光分子可視化了單分子EGFR與活細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白包被結(jié)構(gòu)（clathrin-coated structures, CCS）相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，結(jié)果表明EGFR通過(guò)與CCSs周圍的連接蛋白發(fā)生弱相互作用，來(lái)鑒別適合EGFR向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)可“騎行”的CCSs結(jié)構(gòu)。
總的來(lái)說(shuō)，本文開(kāi)發(fā)了一種用于活細(xì)胞成像的熒光染料，有超高的光穩(wěn)定性，對(duì)研究蛋白質(zhì)分子機(jī)制具有重大潛力。
本文作者：FTY
責(zé)任編輯：WYQ
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02584-0
文章引用：10.1038/s41592-024-02584-0
