分享一篇發(fā)表在Nature Communication上的文章，題目為“Hyperbaric oxygen enhances tumor penetration and accumulation of engineered bacteria for synergistic photothermal immunotherapy”。在本文中，作者采用cypate分子修飾大腸菌桿Nissle1917(EcN)，產(chǎn)生用于光熱療法的EcN-cypate，隨后可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)；同時(shí)采用高壓氧(HBO)非侵入性療法以高效消耗致密的細(xì)胞外間質(zhì)，從而增加腫瘤內(nèi)細(xì)菌的積累，從而實(shí)現(xiàn)理想的腫瘤根除。
細(xì)菌介導(dǎo)治療是一種有前途且強(qiáng)大的癌癥治療模式，具有腫瘤靶向增殖和激活抗腫瘤免疫應(yīng)答等能力，可以與其它抗腫瘤技術(shù)聯(lián)用以增強(qiáng)癌癥治療效果。然而，細(xì)菌大小、致密穿透深度(ECM)和高腫瘤間質(zhì)壓力，腫瘤內(nèi)遞送效率不足和工程細(xì)菌的低細(xì)胞外間質(zhì)仍然是不可避免的挑戰(zhàn)，限制了癌癥治療的有效性，為此亟需開發(fā)簡(jiǎn)便、通用的策略以實(shí)現(xiàn)有效的瘤內(nèi)遞送和細(xì)菌的深度瘤內(nèi)滲透方法。高壓氧(HBO)治療是克服腫瘤缺氧，消耗ECM和促進(jìn)藥物在實(shí)體瘤中滲透的最有效方法之一，已被廣泛用作改善化療，光動(dòng)力療法，放療，PTT和免疫療法的治療性能的輔助方法。在本文中，作者使用兼性厭氧益生大腸桿菌 Nissle 1917(EcN)作為模型細(xì)菌來研究高壓氧對(duì)腫瘤治療過程中細(xì)菌活性的影響。
高壓氧可以增加血液和組織中的氧氣壓力，這可能引導(dǎo)兼性厭氧菌(EcN)在高壓氧治療過程中對(duì)低氧腫瘤表現(xiàn)出改善的靶向能力；另一方面，HBO也可以消耗致密的ECM，以增強(qiáng)腫瘤內(nèi)滲透和ECN的積累。如圖1a所示，通過酰胺化反應(yīng)，用光熱熒光團(tuán)(cypate)修飾EcN的表面，得到EcN-cypate。高壓氧治療后促進(jìn)了EcN-cypate在腫瘤組織中的積累。在近紅外(NIR)激光照射下，EcNcypate實(shí)現(xiàn)PTT并觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)，其引發(fā)全身性免疫應(yīng)答，如樹突狀細(xì)胞(DC)成熟以根除腫瘤(圖1b)。
首先，本文探究了HBO是否能夠消耗致密的ECM以促進(jìn)細(xì)菌(EcN)在實(shí)體瘤內(nèi)的積累和滲透，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)有效的基于細(xì)菌的癌癥治療是必不可少的(圖2a)。作者從“ HBO +”組(其中荷瘤小鼠以1.5大氣絕對(duì)值(ATA)用 HBO 處理2小時(shí))和對(duì)照組(沒有 HBO 處理，“ HBO-”)中的小鼠收集腫瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。具體而言，火山圖和熱圖結(jié)果顯示共檢測(cè)到184個(gè)(95個(gè)上調(diào)和89個(gè)下調(diào))差異表達(dá)基因(DEGs)(圖2b，c)，表明 HBO 治療后腫瘤的顯著變化。此外，還對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了GO(Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)富集分析。如 GO 富集分析結(jié)果(圖2d)所示，與 ECM 相關(guān)的 DEGs (例如細(xì)胞外區(qū)域，細(xì)胞外液，細(xì)胞外間質(zhì)，外包封結(jié)構(gòu)和含膠原蛋白的細(xì)胞外間質(zhì))和一些生物過程(BP)相關(guān)的 DEGs (例如細(xì)胞粘附，生物粘附和細(xì)胞-細(xì)胞粘附)在 HBO 處理后顯著受到影響。此外，KEGG 富集分析結(jié)果表明，DEG 在 ECM 相關(guān)途徑(例如 ECM 受體相互作用)和細(xì)胞粘附相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如粘著斑)中富集(圖2e)。此外，ECM的兩個(gè)主要組分(纖連蛋白和膠原)被染色，并且在 HBO 處理后觀察到纖連蛋白和膠原的顯著降低(圖2f，g) ，進(jìn)一步證明了 ECM 的消耗。
接下來，作者探究了HBO對(duì)兼性厭氧菌(EcN)瘤內(nèi)遞送的影響。為了監(jiān)測(cè)EcN的分布，本文選擇發(fā)射紅色熒光的表達(dá)mCherry的EcN(稱為EcN-mCherry)作為模型細(xì)菌。為了進(jìn)行體外研究，本文進(jìn)一步構(gòu)建了直徑約500 μm的三維培養(yǎng)的多細(xì)胞球體(MCS)。如圖3a所示，將EcN-mCherry細(xì)胞與MCS孵育12小時(shí)，并獲得共聚焦圖像以記錄MCS的初始狀態(tài)(0小時(shí))。之后，“ HBO +”組的MCS接受 HBO 處理(1.5 ATA，2h) ，隨后用共聚焦顯微鏡觀察。最初，EcN-mCherry 在“ HBO-”和“ HBO +”組中主要位于 MCS 的外部區(qū)域。然而，在 HBO 處理后，在“ HBO +”組中觀察到促進(jìn)的 EcN-mCherry 的滲透/積累 (圖3b)。由于其缺氧靶向性，ECN 細(xì)胞傾向于向缺氧區(qū)遷移。在高壓氧處理過程中，MCS 外部環(huán)境中的氧濃度增加，在 MCS 內(nèi)部形成相對(duì)缺氧的狀態(tài)。因此，EcN 更傾向于穿透 MCS 的缺氧內(nèi)部區(qū)域，從而在 HBO 處理后實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的積累。為了驗(yàn)證這一猜想，作者靜脈內(nèi)(i.v.)將EcN-mCherry 注射到4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞系)荷瘤小鼠中，在注射后12小時(shí)用 HBO (1.5 ATA，2小時(shí))進(jìn)一步處理。有趣的是，在 HBO 處理組中觀察到 EcN-mCherry 在腫瘤組織中的顯著增加和更廣泛的分布(圖3c)，表明HBO處理促進(jìn)了TME內(nèi)細(xì)菌的積累和滲透。此外，與對(duì)照組相比，來自“ HBO +”組的“63×”放大圖像顯示腫瘤細(xì)胞的不太緊密的分布，這一結(jié)果表明，高壓氧可能耗盡細(xì)胞外基質(zhì)和影響細(xì)胞粘附，與 GO 富集分析結(jié)果一致(圖2d)。為了進(jìn)一步闡明 HBO 對(duì) EcN 向腫瘤浸潤的影響，作者在注射1×107集落形成單位(CFU) EcN 后的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12,36和60h)用 HBO (1.5 ATA，2h)處理小鼠3次，并通過集落計(jì)數(shù)量化腫瘤中的細(xì)菌數(shù)量。如圖3d所示，HBO處理組24/48/72小時(shí)的 EcN 集落計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組，這與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果一致(圖3e)。值得注意的是，“ HBO +”組的 EcN 水平在48小時(shí)幾乎達(dá)到平臺(tái)(圖3e)，表明只有兩次 HBO 處理足以實(shí)現(xiàn)腫瘤內(nèi)顯著增加的細(xì)菌積累。
本文進(jìn)一步探究了cypate修飾的最適濃度，根據(jù)掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果(圖4a)，ECN的形態(tài)與ECN-cypate的形態(tài)相似，表明cypate修飾對(duì)細(xì)菌的干擾可以忽略不計(jì)。隨后進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，證明了cypate在ECN表面的共軛是成功的。如圖4b所示，胞果酸的紅色熒光顯示在細(xì)菌表面。此外，EcN-cypate的負(fù)zeta電位的絕對(duì)值相對(duì)于EcN(EcNcypate為-48.5 ± 4.7 mV，EcN 為 -21.7 ± 3.4 mV，圖4c)增加，因?yàn)槊總€(gè)共軛的cypate分子含有兩個(gè)羧基。此外，EcN-cypate (1185 ± 188nm)相對(duì)于 EcN (953 ± 142nm)(圖4d)呈現(xiàn)增加的流體動(dòng)力學(xué)直徑，以及與游離cypate(圖4e)相似的吸收峰，證明cypate成功的綴合到細(xì)菌上。之后，作者證明了cypate修飾對(duì)EcN是安全的，因?yàn)镋cN和ECN-cypate的生長(zhǎng)曲線非常相似(圖4f)。總的來說，修飾的EcN-cypate保留了其原有的形態(tài)和生存能力。
為了測(cè)試cypate對(duì)PTT的潛在作用，本文使用熱成像相機(jī)測(cè)量了含ECN-cypate的懸浮液的實(shí)時(shí)溫度變化。如圖4g所示，當(dāng)用NIR激光(808nm，1W/cm2)連續(xù)照射含有 EcN-cypate的懸浮液7分鐘時(shí)，記錄到明顯的溫度變化，導(dǎo)致EcN-cypate的形態(tài)改變。此外，EcN-cypate 表現(xiàn)出多重加熱電位，這可能使進(jìn)一步重復(fù)PTT(圖4h)。根據(jù)MTT測(cè)定結(jié)果，EcN-cypate 在沒有激光照射的情況下呈現(xiàn)良好的細(xì)胞相容性，并且在5 μg/mL濃度下在激光照射下具有顯著的細(xì)胞毒性(圖4i)。為了清楚地顯示 EcN-cypate 的 PTT 效應(yīng)，將不同處理后的4T1細(xì)胞與鈣黃綠素乙氧基甲酯(calcein-AM)和碘化丙啶(PI)共染色，并且來自死亡細(xì)胞的紅色熒光信號(hào)表明 EcN-cypate 的有效的基于 PTT 的細(xì)胞殺傷能力(圖4j)。
本文推測(cè)，EcN-cypate介導(dǎo)的 PTT 可以殺死癌細(xì)胞以釋放 DAMP，這反過來又促進(jìn)DC的成熟(圖5a)。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本文在不同的實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)了三種主要DAMP的釋放，即三磷酸腺苷(ATP)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)和鈣網(wǎng)蛋白(CRT)。如圖5b，c所示，與其他組相比，用EcN-cypate孵育的細(xì)胞隨后激光照射(“激光 +”組)表現(xiàn)出細(xì)胞外ATP和HMGB1濃度的顯著增加。此外，還測(cè)量了CRT暴露水平，“激光 +”組呈現(xiàn)最高水平的CRT(圖5d)，在質(zhì)膜表面檢測(cè)到明顯的CRT信號(hào)(圖5e)。共聚焦成像結(jié)果顯示，與“激光-”組相比，“激光 +”組在細(xì)胞核內(nèi)顯示更少的熒光信號(hào)(圖5f)。流式結(jié)果顯示，“激光 +”組成熟BMDC的比例(74.0%)顯著高于對(duì)照組(28.4%)和“激光-”(29.5%)組(圖5g)。此外，相應(yīng)的定量分析進(jìn)一步證實(shí)“激光 +”組成熟 BMDC 的百分比最高(圖5h)。
為了研究HBO是否對(duì)工程菌(EcN-cypate)具有與天然細(xì)菌(EcN)相當(dāng)?shù)挠绊懀疚臋z測(cè)了4T1荷瘤小鼠模型中EcN-cypate的體內(nèi)分布。如圖6a所示，EcN-cypate處理組比游離cypate處理組提供更有效的cypate瘤內(nèi)遞送，這可能歸因于EcN的缺氧靶向能力。此外，HBO治療顯著改善了EcN-cypate的腫瘤內(nèi)遞送，在注射后48小時(shí)觀察到最大熒光強(qiáng)度(圖6a)。主要器官的離體圖像顯示胱氨酸主要被肝臟清除(圖6a)。另一方面，半定量分析cypate分布進(jìn)一步驗(yàn)證了HBO在促進(jìn)基于細(xì)菌的藥物系統(tǒng)的傳遞中的關(guān)鍵作用(圖6b)。HBO治療后，缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)的表達(dá)下降(圖6c)，表明HBO克服了腫瘤缺氧。接下來，本文評(píng)估了ECN-cypate的體內(nèi)PTT效應(yīng)。如圖6d所示，在近紅外激光照射后15分鐘內(nèi)，EcN-cypate和“ EcN- 半胱氨酸 + HBO”組均顯示出顯著的腫瘤溫度升高。具體而言，“ EcN-cypate + HBO”組的溫度在照射期間可以增加到48°C(圖6e)，這足以實(shí)現(xiàn)有效的PTT。
進(jìn)一步，本文研究了這種HBO聯(lián)合PTT治療的體內(nèi)抗腫瘤的性能。如圖7a所示，作者依次將HBO(1.5 ATA，2h)和激光照射(808nm，1W/cm2,15分鐘)應(yīng)用于EcN注射的小鼠，并在第二天重復(fù)上述過程以增強(qiáng)治療效果。如圖7b-g所示，“EcN- cypate + HBO + 激光”組在所有組中表現(xiàn)出最佳的治療結(jié)果，驗(yàn)證了HBO和EcN-cypate介導(dǎo)的PTT組合的高抗腫瘤效力。此外，“EcN-cypate + HBO”組顯示出比EcN-cypate組更強(qiáng)的抗腫瘤作用(圖7b，d，e)。為了觀察不同治療對(duì)腫瘤區(qū)域的損傷，本文分別用蘇木精和伊紅(H&E)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)定試劑盒對(duì)腫瘤切片進(jìn)行染色。根據(jù)定量TUNEL測(cè)定試劑盒染色結(jié)果，“EcN- 胱氨酸 + HBO + 激光”組顯示最多的TUNEL熒光信號(hào)(圖7h)，圖7i表明該組中最凋亡的細(xì)胞。然后作者評(píng)估了cypate的體內(nèi)生物安全性，所有組之間的體重曲線表現(xiàn)出可忽略的波動(dòng)(圖7j)。
最后本文還探究了HBO偶聯(lián)和EcN-cypate介導(dǎo)的PTT(HBO 偶聯(lián) PTT)重編程TME，HBO增強(qiáng)的光熱免疫治療結(jié)合PD1阻斷治療來預(yù)防肺轉(zhuǎn)移。
本文作者：MKQ
責(zé)任編輯：TZM
DOI: 10.1038/s41467-024-49156-6
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