分享一篇發表在Nat. Chem. Biol.上的文章，題目為“TOPO-seq reveals DNA topology-induced off-target activity by Cas9 and base editors”，通訊作者是武漢大學中南醫院的張楹教授，她們課題組主要的研究方向為通過CRISPR技術直接修復胞內致病突變，或增強免疫細胞抗腫瘤功能來治療癌癥。
CRISPR-Cas基因組編輯工具是革命性的技術，在基礎研究和轉化醫學中具有廣泛的應用，檢測脫靶事件的發生對于確保該技術的安全性至關重要。目前檢查脫靶的方法主要關注于gRNA的錯配，但是DNA的拓撲結構也會影響前間隔序列鄰近基序（PAM）與Cas9之間的相互作用，從而影響Cas9的切割活性。于是本文作者開發了一種新的方法名為topology-related site identification and sequencing，即TOPO-seq技術來檢測DNA拓撲結構造成的Cas9和堿基編輯器的脫靶。
TOPO-seq主要包括兩步，分別是體外“篩選”和體內“驗證”。體外“篩選”步驟與CHANGE-seq技術相似，但是作者為了構建拓撲結構不同的DNA庫，用溴化乙錠（EB）處理了環狀DNA庫，在EB的作用下，環狀DNA超螺旋程度顯著增加，可以通過調整EB劑量精確控制超螺旋密度。之后作者將三種不同拓撲異構體的環狀DNA文庫與Cas9核糖核蛋白（RNP）復合物孵育，被Cas9切割的DNA隨后與測序接頭連接，并通過二代測序（NGS）確定切割位點。通過體外實驗，作者可以找到對DNA拓撲結構敏感/不敏感的位點。在體內“驗證”步驟中，體外“篩選”得到的脫靶位點在經過基因編輯的目標細胞或者組織中通過多重PCR擴增子測序進行驗證，以確定真正的脫靶位點。
作者在TRAC_site_2和TRAC_site_3這兩個研究得較多的gRNA中驗證了TOPO-seq的可行性。作者將該方法應用于造血干細胞中3個治療性gRNA的脫靶效應研究中，發現了47個脫靶基因座，其中6個是DNA拓撲結構引起的。此外作者還發現DNA拓撲結構會影響Cas9對間隔區錯配的容忍度，超過50%的脫靶位點包含6個錯配。
?作者將該方法應用于造血干細胞中3個治療性gRNA的脫靶效應研究中，發現了47個脫靶基因座，其中6個是DNA拓撲結構引起的。此外作者還發現DNA拓撲結構會影響Cas9對間隔區錯配的容忍度，超過50%的脫靶位點包含6個錯配。
綜上所述，作者開發了一種名為TOPO-seq的方法，可以研究DNA拓撲結構導致的Cas9和堿基編輯器的脫靶。
本文作者：LZ
責任編輯：MB
DOI：10.1038/s41589-025-01867-7
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01867-7
