推薦一篇發(fā)表在Nat. Chem. Biol.上的論文，題目為“Engineering covalent small molecule–RNA complexes in living cells”，通訊作者是因斯布魯克醫(yī)科大學的Alexandra Lusser教授和因斯布魯克大學的Ronald Micura 教授， Lusser教授致力于染色質組裝與重塑領域的研究，Ronald Micura 教授的研究方向是RNA的化學修飾。
在RNA研究中，理解RNA的功能和動態(tài)行為對揭示生物過程至關重要。在精確標記和追蹤RNA動態(tài)方面，傳統(tǒng)的非共價標記方法存在一定的局限性。盡管已有基于探針的技術用于識別反應性RNA，這些方法反應慢、效能差，或依賴光激活；并且，現(xiàn)有的技術通常依賴蛋白酶或復雜反應，難以普適應用。因此，開發(fā)不依賴蛋白酶的小分子共價標記技術，成為提高RNA研究精度和應用潛力的關鍵挑戰(zhàn)。在這項研究中，作者探索了一種基于結構引導的方法，通過將配體修飾為具有親電基團，使其能夠與RNA結合位點的鳥嘌呤發(fā)生反應，從而將小分子配體共價連接到其對應的RNA靶標上。
作者首先在已充分表征的preQ1 I型核糖開關（preQ1-I）上開展研究。preQ1-I具有特定的配體結合口袋，作者對該結合口袋進行了詳細評估，發(fā)現(xiàn)7-氨基甲基-7-脫氮嘌呤的氨基甲基基團適合通過一個短鏈（三個碳原子長）的手柄進行親電衍生化，這一衍生化可以使其與鳥嘌呤-5（G5）的N7發(fā)生親核反應。作者選擇短小的3-溴丙基手柄，非常適合與N7-G5親核體發(fā)生SN2反應；同時，核酸堿基類似物的配體衍生物通過氫鍵相互作用，進一步增強了與RNA的結合。因此，作者合成了配體Brc3DPQ1，與preQ1 RNA在接近生理條件下孵育時，獲得了大量的RNA加合物，并通過優(yōu)化條件進一步提高了反應產(chǎn)率。接下來，作者通過高分辨質譜確認了在核酸上的修飾位點為G5核苷。接下來，作者通過一系列實驗對連接子長度、離去基團的種類、反應的位點以及不同類型RNA結構進行測試，揭示了烷基化反應的關鍵因素。通過這些實驗，作者深入了解了影響preQ1核糖開關烷基化反應的多個因素，并為優(yōu)化反應條件和提高反應效率提供了理論依據(jù)。
熒光激活適配體(FLAPs)已經(jīng)發(fā)展成為可對活細胞中的RNA進行成像的一種高效工具。但目前開發(fā)的FLAPs系統(tǒng)，它們的熒光分子與適配體是以非共價方式結合的，容易被洗脫導致熒光信號喪失，因此，作者開發(fā)了一類新的共價FLAP系統(tǒng)。作者選擇了Pepper適配體，能夠識別類似于綠色熒光蛋白的染料分子HBC，通過三維結構分析，作者發(fā)現(xiàn)Pepper適配體的結合口袋可以與HBC的反應性手柄發(fā)生化學反應，并設計出了一種3-溴丙基修飾的衍生物Brc3HBC。進一步的優(yōu)化通過將溴化物換成甲磺酸酯（MsOc3HBC），提高了溶解度并進一步增強了反應速率和產(chǎn)率。此外，作者還生成了帶有第二個功能基團的Pepper配體，用于生物正交化學反應，從而pull-down目標RNA的相互作用組。
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作者設計了兩個質粒用于在人類293T細胞中表達這些適配體，并通過轉染和配體處理，實現(xiàn)了適配體與配體的穩(wěn)定共價結合。接下來，作者通過實驗表明，MsOc3HBC配體能夠穩(wěn)定地與Pepper適配體共價結合，并且在細胞內(nèi)保持較高的信號強度，克服了非共價配體在細胞洗滌過程中的信號喪失問題。進一步的超分辨率顯微鏡成像表明，Pepper RNA在核斑點周圍形成明確且動態(tài)的結構，表明該系統(tǒng)能可靠地跟蹤RNA在細胞內(nèi)的運動，而不受配體交換的影響。
總之，該研究提出了一種共價連接RNA適配體與小分子配體的新方法，增強了細胞成像和RNA動力學研究的穩(wěn)定性與靈敏度，并可應用于RNA富集與藥物靶向，推動了RNA藥物開發(fā)。
本文作者：ZJ
責任編輯：WYQ
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01801-3
文章引用：10.1038/s41589-024-01801-3
