分享一篇發表在Nature chemical biology上的文章，文章的題目是“μMap proximity labeling in living cells reveals stress granule disassembly mechanisms”，作者是來自普林斯頓大學杰出化學教授David W. C. MacMillan。其研究領域主要包含有機催化、級聯催化、協同催化、光還原催化和金屬光還原催化及其在天然產物和藥物的全合成中的應用。利用光催化研究復雜的生物環境。
細胞過程通過多種結構的隔室化進行調控，其中包括通過液-液相分離形成的無膜細胞器。這樣的凝聚體主要由核酸和蛋白質組成，在調節基因表達、應對壓力和信號傳導網絡中發揮關鍵作用。應激顆粒（SGs）作為其中一種相分離的凝聚體，受到廣泛關注，因為它們在細胞應激時瞬時形成，并在去除應激因子后以動態方式解體?，F有證據表明，SGs不僅在應激條件下暫時儲存和保護某些mRNA和蛋白質，還會對RNA加工、細胞器功能和整體細胞命運產生深遠影響。此外，凝聚體的組織失調與多種神經退行性疾病相關。因此，理解SG的動態變化可以揭示細胞組織的基本規律，并促進新的治療方法的發展。
SG解體被認為涉及多種后轉錄修飾，包括泛素化。泛素化在應激誘導的SG解體中起重要作用。SG的組成和動態變化也被發現與特定的應激狀況高度相關。盡管研究這些瞬時凝聚體的重要性顯而易見，但其研究仍面臨重大挑戰。由于缺乏膜結構且形狀和大小變化多端，傳統的分離方法難以有效地分離和研究這些液滴。此外，凝聚體的組成在形成和解體過程中高度動態，完全表征這一變化的蛋白質組需要高時空分辨率的技術。在這種背景下，鄰近標記法（μMap）被提出，作為一種強大且通用的方法來研究瞬態蛋白質-蛋白質互動。
本研究擴展了μMap的作用：結合HaloTag，將細胞滲透性的Ir催化劑安裝到感興趣的細胞內蛋白上，研究影響SG解體的機制。
為了建立HaloMap平臺以進行顆粒蛋白組分析，作者首先在HEK293細胞中穩定表達HaloTag–G3BP1融合蛋白。與此同時，細胞與可透膜的μMap Ir催化劑孵育。μMap Ir催化劑帶有一種聚乙二醇（PEG）4-己基氯配體，可與 HaloTag發生共價烷基化反應（圖1a）。然后引入生物素-雙吖丙啶探針進行后續藍光光激活以標記鄰近蛋白（圖1b）。為了誘導顆粒形成，作者應用了亞砷酸鈉處理應激（AS；500μM NaAsO2）。通過免疫熒光技術，作者驗證了在應用AS時，生物素化信號與HaloTag–G3BP1的細胞質顆粒結構的共定位，表明這些相分離結構的高分辨率鄰近標記（圖1c）。
接下來，作者利用label-free定量蛋白組學檢測SG蛋白組成變化。作者識別出371個假定的G3BP1相互作用者作為應激誘導顆粒候選者（圖1d）。這些相互作用者與先前報道的 SG 蛋白具有很大的重疊性，而最高度富集的候選者（NUFIP2，UBAP2L，CAPRIN1等）一貫被認為是顆粒的核心結構組分（圖1d）。這些結果有效驗證了方法的準確性，并證實了之前關于AS誘導顆粒組成的研究。同時，作者也鑒定到之前并未報道的蛋白。作者通過免疫熒光技術確認這些相互作用蛋白在AS下定位于SGs（圖1e）。G3BP1及若干相關SG蛋白也被認為在正常條件下預先相互作用。作者假設HaloMap也可以分析這些應激前相互作用。作者比較了在沒有應激下HaloTag–G3BP1的相互作用組，并識別出14個高度富集的蛋白，包括USP10，G3BP2，FXR2和YTHDF3等（圖1f）。這些相互作用蛋白被推測與G3BP1形成“預置”復合物，可能在SGs的快速形成中起作用?？傊?，這些發現表明細胞內HaloMap可以有效且準確地捕獲不應激或應激誘導的G3BP1/SG相互作用組。
在建立了HaloMap標記平臺后，作者接下來試圖分析SG解聚過程中發生的蛋白組學變化，以捕捉可能的關鍵調節因子。SG在新鮮培養基中約2小時后完全解聚（圖2a）。基于這些動態學，作者在去除AS后的30分鐘（D30）、60分鐘（D60）和120分鐘（D120）進行HaloMap標記，以代表解聚過程的早期、中期和晚期（圖2b）。從每個時間點的HaloTag-G3BP1與HaloTag-NES標記比較中，鑒定到698個SG相互作用蛋白水平變化。隨著顆粒的解聚，大約70%的顆粒相互作用蛋白的富集隨著恢復而降低（圖2c）。然而，作者對一組在恢復期間呈現出增加關聯的蛋白質（n=203）的出現感到興趣，因為這些可能是顆粒解聚的調控蛋白。GO分析顯示出明顯富集的蛋白質，主要是正向調節或啟動翻譯的蛋白質，即隨著細胞從應激中恢復，mRNA從顆粒的釋放和翻譯。此外，多個與泛素化和蛋白質質量控制途徑相關的蛋白質也顯示出富集（圖2c）。接下來，通過免疫熒光，作者觀察到在應激處理后，泛素信號與G3BP1/顆粒的強重疊，這表明這些凝聚物含有多泛素化的蛋白。此外，作者確認在應激和早期恢復時（應激后30分鐘）整體多泛素水平的上調（圖2e）。為了進一步了解泛素化對顆粒動力學的影響，作者接下來測試了在存在TAK-243（MLN7243），一種強效的泛素激活酶（UAE）抑制劑的情況下，凝聚物的形成和解聚（圖2f）。作者在不同時間段抑制泛素化（1）在顆粒形成和解聚的整個周期（TAK-243-1），（2）在顆粒形成期間（TAK-243-2），以及（3）僅在解聚期間（TAK-243-3；圖2g）。這些比較結果顯示，在任何一個時期（組1，2或3）抑制泛素化對顆粒形成的影響較小。然而，當在顆粒形成期間抑制泛素化時（TAK-243-1和TAK-243-2）觀察到了顯著延遲的顆粒解聚，而在僅在解聚期間施用TAK-243時（TAK-243-3）則觀察到了輕微的延遲（圖2h）?？偟膩碚f，這些結果強烈表明泛素化對顆粒解聚至關重要。? ?
圖2 HaloMap分析泛素化對于SG解聚是關鍵的修飾。
3.相互作用組圖譜 (+/?)TAK-243 確定候選調節因子
作者因此在HaloTag–G3BP1穩定細胞系上對比了有無TAK-243處理下的細胞在應激前及整個解聚過程中的情況（圖3a）。鑒定到由TAK-243抑制多聚泛素化所觸發的顆粒蛋白組差異。作者聚焦于與泛素通路相關的差異富集蛋白，首先搜索了E3連接酶，識別出了在（+）TAK-243細胞中于應激后富集的幾種候選蛋白（圖3b、c）。其中包括E3連接酶，識別泛素翻譯后修飾（PTMs）的蛋白以及作為顆粒解聚的蛋白。作者還識別出幾種與自噬相關的泛素受體，包括SQSTM1、HDAC6和TOLLIP，所有這些蛋白都已被證明能夠識別聚泛素化底物以進行自噬靶向和降解（圖3d、e）。
圖3 顆粒蛋白組在應激前到晚期解體狀態中的變化，包括有（+）和沒有（-）TAK-243的情況。
作者在HaloMap實驗中發現HECT E3連接酶的富集。為了研究HECT E3連接酶是否在SG的解體中起作用，作者在刺激和恢復期間用HECT連接酶特異性抑制劑heclin處理細胞。在120分鐘的恢復期（D120），heclin處理的樣本中仍然殘留大量的顆粒（圖4a，b）。作者接下來探索了特定的HECT E3連接酶或其相關結合蛋白是否調節SG（應激顆粒）的解體。為此，作者對在HaloMap中識別的每個候選蛋白進行了siRNA敲低實驗，包括所有四種連接酶（WWP2、ITCH、NEDD4和NEDD4L）以及兩個結合蛋白（NDFIP1和NDFIP2）。單獨敲低ITCH、NEDD4L和NDFIP1導致SG解體的明顯延遲。鑒于這些連接酶之前未與顆粒相關聯，作者通過針對顆粒標記物G3BP1的免疫熒光確認了它們的亞細胞定位，觀察到它們在NaAsO2處理后被招募到SG中（圖4e）。過表達或siRNA敲低ITCH或NEDD4L均未影響初始的顆粒形成，這與作者對TAK-243和heclin抑制多聚泛素化的結果一致（圖4e）。綜合這些數據，表明特定的HECT E3連接酶，包括ITCH、NEDD4L及其相關結合蛋白NDFIP1，直接在泛素介導的SG解體中發揮調節作用。
作者接下來希望確定HECT依賴性泛素化在顆粒中的具體機制及其在控制解體速率中的作用。作者最初使用TUBE方法對全泛素底物變化分析，比較在有（+）和無（?）heclin的情況下形成顆粒的細胞（圖4f）。GO分析顯示受到heclin影響的泛素組在囊泡介導的運輸、K63多聚泛素鏈調節和自噬方面表現出功能富集。接下來，作者重復了這個泛素組分析實驗，但使用K63特異性TUBE富集（圖4f）。在此過程中，作者識別到181個通常在應激下K63特異性泛素化增加但在heclin處理后顯著降低修飾水平的蛋白，其中31個已知是SG成分。免疫熒光分析顯示heclin處理期間顆粒區域內K63特異性泛素信號的重疊減少（圖4g）。這些數據表明HECT E3連接酶通過調控特定顆粒蛋白上的K63多聚泛素化來調節顆粒的解體。? ?
后續，作者鑒定到泛素受體TOLLIP蛋白，并通過自噬途徑介導顆粒動態。
在本研究中，作者應用基于HaloTag的平臺（μMap）進行鄰近標記，以表征活細胞中的應激顆粒動態變化。揭示了若干與泛素相關的調節因子，包括HECT（與E6AP C末端同源）E3連接酶ITCH和NEDD4L，以及泛素受體TOLLIP，作為顆粒解體的關鍵介導因子。此外，作者還識別出一個促進顆粒清除的自噬相關通路?？偟膩碚f，這項工作建立了一種常規的光催化的鄰近標記方法，用于揭示細胞內蛋白質相互作用組，并發現了調節應激顆粒動態的先前未探討的機制。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01721-2
原文引用：doi: 10.1038/s41589-024-01721-2
