介紹一篇發(fā)表在Nature chemistry上的文章“Selection of a promiscuous?minimalist cAMP phosphodiesterase from a library of de novo designed proteins”，通訊作者是普林斯頓大學(xué)的Michael Hecht和Florian Hollfelder教授，他們的研究方向是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)與液滴微流控技術(shù)。
生命系統(tǒng)依賴于催化加速的化學(xué)反應(yīng)，目前生物圈的大多數(shù)酶都相對較大，細(xì)菌與真核生物的蛋白平均長度分別為320個和472個氨基酸。研究者可以通過學(xué)習(xí)現(xiàn)有的蛋白結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)這些較大且高活性的酶，然而從生命進(jìn)化之初，要理解這種催化功能是如何從蛋白序列中產(chǎn)生則要困難得多。本文作者就以短肽為起點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選流程，進(jìn)化得到了一個僅有59個氨基酸殘基的酶，可以在錳離子存在條件下將磷酸二酯鍵水解，這將有助于人們更好地理解酶催化功能如何從肽序列中產(chǎn)生的。
本文作者首先基于一個102個殘基長的4-螺旋束蛋白S-824為起始支架，其本身與任何天然蛋白質(zhì)無關(guān)，且沒有檢測到磷酸酯酶的活性，但其結(jié)構(gòu)可以承受巨大的序列多樣性，從而最大限度地減少犧牲折疊的情況。其次，作者在篩選序列隨機(jī)性的同時還將水解酶中的常見輔因子二價金屬離子（錳、鋅、鈣）混合添加到篩選中，從而允許在單個實(shí)驗(yàn)中篩選整個文庫。最后作者將表達(dá)單個文庫序列的單個細(xì)菌與熒光底物和金屬在微流控液滴中進(jìn)行裂解、測定和分選，通過測序液滴中的質(zhì)粒DNA即可鑒定分選出的目標(biāo)蛋白。
?作者通過微流控液滴在4hr內(nèi)分選了1030萬個液滴（相當(dāng)于440萬個克隆），并選出了熒光度最高的0.2-0.5%個液滴，在更嚴(yán)格的情況下進(jìn)行二次分選，最后明顯富集出了具有磷酸酯酶活性的蛋白。作者在其中重點(diǎn)分析了一個具有高催化活性、高表達(dá)且具有良好溶解性的克隆mini-cAMPase，在錳離子存在條件下會產(chǎn)生最好的磷酸酯酶催化活性。作者利用對硝基苯酚作為模型底物進(jìn)行酶特異性的評估，結(jié)果表明這種酶僅催化攜帶單個負(fù)電荷的磷酸二酯和磷酸鹽底物水解，且該活性可以被擴(kuò)展到生物學(xué)重要的磷酸二酯底物。
總之，本文結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與微流控液滴技術(shù)發(fā)展了一種極簡cAMP磷酸二酯酶的篩選方法，有望可以解釋酶催化功能是如何從肽的隨機(jī)序列中進(jìn)化來的，并且可能發(fā)展成為一種成本可控、便于生產(chǎn)的工業(yè)催化方案。
