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推薦一篇發(fā)表在Nature Biotechnology上的文章，題目為“CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models”。通訊作者是來自IMBA分子工程研究所的Ulrich Elling，其課題組致力于基因組學(xué)和測序分析方面的研究。

細胞群的遺傳異質(zhì)性和瓶頸效應(yīng)為傳統(tǒng)CRISPR-Cas9技術(shù)在體內(nèi)模型中的全基因組遺傳篩選帶來巨大挑戰(zhàn)。遺傳異質(zhì)性指腫瘤內(nèi)部的細胞并非都是相同的，它們可能含有不同的基因突變、表達水平和環(huán)境響應(yīng)性；瓶頸效應(yīng)在遺傳篩選中意味著如果只有少數(shù)細胞能成功移植，這些細胞所代表的sgRNA可能無法準確反映整個基因庫的遺傳效應(yīng)。兩者共同作用使體內(nèi)模型的CRISPR-Cas9基因篩選分辨率受限，結(jié)果噪聲大、可重復(fù)性低。

為解決上述問題，本文作者開發(fā)了一種名為CRISPR-StAR（Stochastic Activation by Recombination）的新型遺傳篩選技術(shù)，它通過在每個細胞克隆中引入內(nèi)部對照，即通過4-羥基他莫昔芬誘導(dǎo)表達Cre重組酶，使其激活一半后代細胞中的sgRNA，而另一半保持非活性狀態(tài)，從而在同一克隆內(nèi)生成活性和非活性sgRNA的細胞，實現(xiàn)直接比較，提高遺傳篩選的準確性和分辨率。

作者對比CRISPR-StAR與傳統(tǒng)CRISPR-Cas9篩選方法，發(fā)現(xiàn)CRISPR-StAR能在低“cells/sgRNA”比值條件下靶向核心必需基因，獲得可信的實驗結(jié)果，且結(jié)果的可重復(fù)性高。經(jīng)過優(yōu)化后的CRISPR-StAR表達載體系統(tǒng)能在不同細胞系中以相同的比例激活sgRNA，可見該內(nèi)部控制方法的穩(wěn)健性。

隨后，作者針對人類或小鼠構(gòu)建了一個全基因組范圍的sgRNA文庫，并將其應(yīng)用于具有顯著的低移植率和生長異質(zhì)性的小鼠黑色素瘤模型中，以識別對Braf抑制劑產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵基因。在該實驗中，作者同時比對了CRISPR-StAR和傳統(tǒng)方法在體內(nèi)和體外的基因篩查結(jié)果差異，僅有體內(nèi)模型的CRISPR-StAR基因篩選結(jié)果提供了可信的關(guān)鍵基因。這些基因在體外模型中并未呈現(xiàn)同樣的必需性，可見在體內(nèi)環(huán)境中進行遺傳篩選的重要性。

總的來說，作者所開發(fā)的CRISPR-StAR技術(shù)彌補了傳統(tǒng)CRISPR-Cas9方法在體內(nèi)實驗中的缺陷，提供了一種用于體內(nèi)模型高分辨率遺傳篩選的強大工具，這對于基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都具有重要的意義。通過巧妙的內(nèi)部對照設(shè)計，CRISPR-StAR技術(shù)提高了體內(nèi)模型遺傳篩選的準確性、分辨率和結(jié)果可靠性，為未來的基因功能研究和藥物靶點發(fā)現(xiàn)提供了新的途徑。

本文作者：WZH

責任編輯：FTY

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02512-9

原文引用：10.1038/s41587-024-02512-9

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