分享一篇發(fā)表在Molecular Cell上的文章：Time-resolved profiling of RNA binding proteins throughout the mRNA life cycle，通訊作者是來(lái)自韓國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究所的V. Narry Kim教授和Jong-Seo Kim教授，前者的研究方向是干細(xì)胞、胚胎、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)和病毒中的調(diào)節(jié)RNA和RNA結(jié)合蛋白，后者的研究方向是質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)。
真核生物mRNA的生命周期包括幾個(gè)不同的階段：轉(zhuǎn)錄、前體信使核糖核酸（pre-mRNA）加工、核輸出、翻譯和衰變。在每個(gè)階段，mRNA與一組特定的RNA結(jié)合蛋白（RBPs）相互作用，形成mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（mRNPs）。這些RBPs控制mRNA的活性、定位和穩(wěn)定性，并影響其向生命周期下一階段的過(guò)渡。因此，揭示RBPs的階段特異性庫(kù)對(duì)于理解mRNA調(diào)控至關(guān)重要。由于mRNA在其生命周期中不斷改變其蛋白質(zhì)伴侶，但由于缺乏時(shí)間分辨率數(shù)據(jù)，使研究者們對(duì)mRNPs的理解受到限制。
為了解決這一問(wèn)題，本文作者通過(guò)在細(xì)胞中用光活化核糖核苷進(jìn)行脈沖代謝標(biāo)記、UVA交聯(lián)、基于poly(A)的RNA分離富集以及基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，提供了時(shí)間分辨的mRNA相互作用組數(shù)據(jù)。為了鑒定在RNA合成后特定時(shí)間點(diǎn)與mRNA相關(guān)的RBP，作者選擇了4sU脈沖追蹤的時(shí)間分辨mRNA相互作用組分析。作者用4sU對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行10分鐘的代謝標(biāo)記，這是最短的時(shí)間，為蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了足夠量的交聯(lián)材料。標(biāo)記10分鐘后，洗去游離的4sU，然后孵育到所需的時(shí)間點(diǎn)。作者選擇了從0到5小時(shí)的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0、15、30、45、60、90、120、180、240和300分鐘），這覆蓋了已報(bào)導(dǎo)的人類mRNA半衰期（平均6.9小時(shí)；中位數(shù)3.4小時(shí)）的大部分階段。通過(guò)將細(xì)胞暴露于冰上的UVA照射，在4sU標(biāo)記的RNA及其密切接觸的相關(guān)蛋白之間誘導(dǎo)光交聯(lián)，并立即收獲細(xì)胞。細(xì)胞裂解后，用oligo(dT) beads捕獲含poly(A)的mRNA分子，并在含有4M尿素的嚴(yán)格條件下洗滌，以特異性捕獲直接與4sU標(biāo)記的mRNA結(jié)合的蛋白。利用這種方法，作者在10個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)700多種RNA結(jié)合蛋白（RBP）進(jìn)行定量，并且這些mRNA結(jié)合的順序與已知的功能、亞細(xì)胞位置和分子相互作用非常一致。
有趣的是，作者還觀察到了意想不到的動(dòng)態(tài)RBPs。例如，轉(zhuǎn)錄輸出（TREX）復(fù)合物直到晚期才被檢測(cè)到（最大峰值時(shí)間，67–77分鐘），這表明TREX可能是在mRNA出核后再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這挑戰(zhàn)了目前同時(shí)轉(zhuǎn)錄和mRNA核輸出的觀點(diǎn)。另外，應(yīng)激顆粒蛋白普遍結(jié)合老化的mRNA，表明在mRNA生命周期后期發(fā)揮的潛在作用。
總之，本文研究提供了mRNA生命周期中mRNA-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，這些信息可以在chronology.rna.snu.ac.kr獲取。
文章鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(24)00222-3
原文引用：DOI:?10.1016/j.molcel.2024.03.012
