分裂 GFP 是研究 DNA 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)-互補物結(jié)合（PCB）的一個優(yōu)秀系統(tǒng)；其組成片段 GFP1-10 和 FP11?在解離時不發(fā)熒光，但可以自發(fā)結(jié)合（KD?= 0.5 μM；λex/em = 488/510 nm），導(dǎo)致發(fā)色團成熟從而產(chǎn)生熒光。然而，這種結(jié)合事件要求這些片段彼此靠近，可能需要長達(dá) 24 h 才能達(dá)到最大熒光。因此，作者假設(shè) DNA 支架可以控制這種結(jié)合平衡。在這個結(jié)構(gòu)中，GFP1-10 和 FP11 分別連接到單獨的DNA鏈上（方案1 中的1和2），這些鏈可以雙鏈化以實現(xiàn)端對端分離；這個剛性的雙鏈支架（方案1 中的3）限制了片段之間的結(jié)合。當(dāng)移除雙鏈化鏈時，形成了一個靈活的單鏈支架，允許蛋白質(zhì)自發(fā)結(jié)合（方案1 中的4）。通過雙鏈化不同長度的 DNA 鏈可以改變支架的剛性，從而影響這些片段之間的結(jié)合程度。
方案1. DNA 支架介導(dǎo)的GFP1-10 和 FP11 蛋白補體結(jié)合調(diào)控
研究低于 0.1 μM 和 0.5 μM 的濃度下的支架蛋白，評估分子間相互作用是否影響蛋白質(zhì)-補體結(jié)合（PCB）。根據(jù)時間依賴的熒光測量結(jié)果，0.5 μM 的 1 和 2 的混合物比 0.1 μM 高出約 33 倍的熒光。這個結(jié)果被用作基線，以測量 GFP1-10?和 FP11?之間的分子間蛋白結(jié)合。在該解離常數(shù)條件下，剛性支架?3 上的分裂 GFP 的熒光比未連接的對照組弱約 56%（圖 1a；6）。假設(shè)在濃度等于或高于 KD?時，支架蛋白的熒光主要來自分子間相互作用（例如，支架之間的二聚化；圖 1a，7）。然而，在 0.1 μM 時，未連接的 6 的熒光比剛性支架 3 減少了 30%，作者提出支架蛋白 5 中觀察到的熒光來自于分子內(nèi)相互作用。在 0.1 μM 時，對 3 進(jìn)行TMSD（支點介導(dǎo)的鏈替換）表明，DNA 支架的剛性抑制了分子內(nèi) PCB。當(dāng)用鏈 B’置換后，得到的柔性 DNA 支架 5 的熒光增加，表明 PCB的程度更大（圖 1b）。因此，所有后續(xù)分析都在 0.1 μM 下進(jìn)行，以最小化不希望的分子間相互作用。通過引入置換鏈 B’，可以時間控制 PCB 的程度（圖 1c）。當(dāng)在置換后添加鏈 B 以恢復(fù)剛性支架 8 時，熒光沒有顯著變化。因此，恢復(fù)支架剛性的 DNA 相互作用并沒有誘導(dǎo) GFP1-10?和 FP11?解離。該觀察結(jié)果與先前的報告一致，即 GFP1-10?和 FP11?之間的非共價相互作用導(dǎo)致觀察到不可逆的結(jié)合。因此，本工作中使用的DNA 相互作用不能超越 GFP1-10?和 FP11?之間的結(jié)合。
圖 1. 蛋白結(jié)合的熒光檢測
圖 2. 不同 DNA 支架的長度對 PCB 的影響
DNA 支架的序列特異性應(yīng)該能夠?qū)崿F(xiàn)對 DNA 雙鏈化的正交控制，從而為選擇性和可編程的 PCB 提供可能性。為了測試這個假設(shè)，改變了一個三元蛋白支架的每個部分的剛性，以調(diào)節(jié)不同蛋白質(zhì)組之間的結(jié)合事件（圖 3a）。組裝的分裂熒光蛋白 CFP1-10-FP11?和 YFP1-10-FP11?的UV-vis 激發(fā)/發(fā)射光譜被用來測量蛋白質(zhì)片段結(jié)合事件。然后，每個蛋白質(zhì)片段-DNA 構(gòu)建被組裝并連接成一個三元支架（圖 3a）。接下來，通過引入鏈 E’ 或 F’ 來評估 PCB 的選擇性，以促進(jìn) FP11?和 CFP1-10?之間的結(jié)合形成 CFP，或 FP11?和 YFP1-10?之間的結(jié)合形成 YFP。隨著時間的推移，在完全剛性的支架上，CFP 和 YFP 的熒光強度都略有增加。隨著鏈 E 的 TMSD 的開始，觀察到 CFP 熒光的增加，但 YFP 沒有，這表明它們的結(jié)合受選擇性控制（圖 3b）。類似地，對鏈 F 進(jìn)行了 TMSD，導(dǎo)致 YFP 熒光選擇性增加（圖 3c）。從這些結(jié)果得出結(jié)論，序列特異性的DNA 相互作用使得在多蛋白構(gòu)建中對不同的 PCB 集有正交控制。最后，假設(shè)使用不同化學(xué)計量比的鏈 E’ 和 F’（從 0:6 增加到 6:0）將產(chǎn)生不同的 CFP 與 YFP 比例。在與各自的鏈組合過夜孵化后，CFP 熒光強度隨著鏈 E’ 與 F’ 比例的降低而降低（圖 3d）。另一方面，YFP 熒光強度增加。假設(shè) CFP1-10、FP11?和 YFP1-10?之間的結(jié)合親和力差異將競爭性結(jié)合平衡移向連接到更靈活區(qū)域的蛋白質(zhì)。總的來說，這些結(jié)果表明，增加目標(biāo) DNA 鏈的比例可以有選擇性地增強這些多蛋白組裝中相應(yīng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合。這種控制可以調(diào)節(jié)高階蛋白中特定蛋白-蛋白相互作用的效率。
?圖 3. DNA支架的序列特異性對雙鏈DNA實現(xiàn)選擇性正交控制和可編程 PCB
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c11315
責(zé)任編輯：WXL
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