分享一篇發表在JACS雜志上的文章，題目為“USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK”。文章的通訊作者是西奈山伊坎醫學院的金堅教授和哈佛醫學院的魏文毅教授，長期致力于開發新型PROTAC技術。本文開發了基于USP7的DUBTAC，首次展示了去泛素化酶USP7可用于DUBTAC的開發。
靶向蛋白質降解（TPD）方法可以用于降解導致人類疾病發展的蛋白質。然而，人類疾病是由具有保護功能的蛋白質（如腫瘤抑制蛋白）的表達減少或功能喪失引起的，需要穩定蛋白而不是降解蛋白來對抗疾病。最近通過內源性去泛素化酶來開發去泛素化酶靶向嵌合體（DUBTAC）來去除泛素化并穩定感興趣的蛋白質作為治療手段。目前只有OTUB1去泛素化酶通過共價配體EN523用于 DUBTAC開發，然而，OTUB1共價配體衍生的DUBTAC可能與其他共價抑制劑存在類似的問題，例如引起毒性或超敏反應。因此，利用其他去泛素化酶進行DUBTAC的開發是能夠推動靶向蛋白質穩定領域的發展。
本文報道了第一個基于USP7的DUBTAC的開發，該DUBTAC利用USP7的非共價配體選擇性地穩定靶蛋白（圖1A）。首先，作者選擇先前報道的USP7 ligand #1（圖1B），可以結合并抑制細胞中的USP7，以募集USP7去泛素化酶。USP7 ligand #1和USP7i-#4a復合物結構表明，USP7抑制劑的氨基不在結合口袋中（圖1B-C），可用作linker連接。然后，將 USP7 ligand #1 與CFTR 配體（Lumacaftor）與各種連接劑連接起來，產生化合物1-13（圖2A）。在這13種化合物中，只有7（MS6869）和13兩種化合物可以在細胞中穩定ΔF508-CFTR突變蛋白（圖2B）。使用MS6869研究基于USP7的CFTR DUBTAC的機制，值得注意的是，MS6869增加了CFTR蛋白豐度，但沒有增加其mRNA水平。同時，MS6869引入后出現USP7和CFTR蛋白之間的新相互作用（圖2C），隨后降低了CFTR的泛素化水平（圖2D）。此外，基于USP7的CFTR DUBTAC MS6869以濃度和時間依賴性方式穩定CFTR（圖2E-F）。更重要的是，CFTR蛋白水平的增加可能是功能性的，因為它主要位于質膜上（圖2G）。與USP7配體或CFTR 配體的共同處理在很大程度上消除了MS6869穩定ΔF508-CFTR 突變蛋白的作用（圖2H）。同時，在細胞CFBE41o-4.7ΔF508-CFTR中刪除USP7可以阻斷MS6869穩定CFTR的作用（圖2I），表明 MS6869 誘導的CFTR穩定可能依賴于USP7的去泛素化酶活性。此外，TMT標記質譜（MS）測定發現，MS6869以相對特異性的方式促進CFTR的穩定（圖2J-K）。這些結果表明，USP7可用于使用非共價USP7 配體穩定靶蛋白。
為了進一步證明基于USP7的DUBTAC可以穩定靶蛋白，設計并合成了一系列基于USP7 的AMPK DUBTACs（化合物14-25），通過將USP7 ligand #1與AMPK激動劑991連接起來(圖3A）。AMPK激動劑991可以結合在AMPK ADaM位點，并選擇性激活AMPKβ1亞基而不是AMPKβ2亞基。測量了DUBTACs 處理后AMPK激酶的α和β亞基水平。值得注意的是，三種化合物22、23和24可以穩定AMPKβ1，但不能穩定HeLa?細胞中的AMPKβ2亞型和 AMPKα亞基（圖3B）。對這些先導化合物的進一步評估表明，MS8118（化合物24）在穩定AMPKβ1方面最有效，并伴隨著AMPK下游底物乙酰輔酶A羧化酶（ACC）磷酸化升高（圖3C），而AMPKβ1的mRNA水平不受影響，表明AMPK DUBTAC在翻譯后水平起作用。接下來，選擇MS8118代表 AMPKβ1進行進一步的功能測定。引入MS8118后USP7和AMPKβ1 之間出現新的相互作用（圖3D），這導致細胞內AMPKβ1 泛素化水平降低（圖3E）。此外，MS8118 對 AMPKβ1 穩定的作用可能會被USP7配體和AMPK配體（圖3F）或通過消耗內源性USP7阻斷（圖3G），表明MS8118對AMPKβ1蛋白穩定性的影響可能是通過募集USP7去泛素化AMPKβ1。為了進一步確定DUBTAC誘導的AMPKβ1穩定是否會影響細胞功能，進行了Oil Red O染色測定作為下游讀數。與AMPKβ1穩定結果一致，MS8118以及化合物23在較小程度上損害了HeLa細胞中的脂質積累（圖3H）。鑒于AMPK在癌癥中也發揮細胞環境依賴性腫瘤抑制作用，進一步確定了這些AMPK DUBTAC是否影響腫瘤細胞生長。值得注意的是，在集落形成試驗中MS8118、22 或 23 減小了集落大小（圖 3I）。
接下來，使用另一種USP7非共價抑制劑GNE6776（圖1C），它與AMPK亞基具有不同的結合模式，可以抑制細胞中的USP7，作為USP7配體產生一系列新的基于USP7的AMPK DUBTAC化合物26-36（圖4A）。與USP7 ligand #1衍生的AMPK DUBTAC相比，GNE6776衍生的AMPK DUBTAC對AMPKβ1的穩定性影響最小（圖 4B）。相反，55（MS8655）、56（MS8656） 和 57（MS8657） 三種化合物優先增加了HeLa細胞中AMPKβ2的蛋白穩定性（圖4B）。進一步的分析表明，MS8655、MS8656 和 MS8657 主要以濃度依賴性方式穩定 AMPKβ2，而AMPKβ1僅受到中度影響（圖4C）。此外，AMPKβ2的mRNA 水平不受三種AMPK-DUBTAC（MS8655、MS8656 和 MS8657）的影響，表明這些化合物對AMPKβ2的翻譯后調控。接下來，使用AMPKβ2的一個代表性DUBTAC（MS8657） 被用于進一步的功能測定。與MS8118 類似，MS8657引入了USP7和AMPKβ2之間的新相互作用（圖4D），隨后降低了AMPKβ2的泛素化水平（圖4E）。此外，MS8657對AMPKβ2穩定作用被 USP7 和 AMPK 的配體（圖4F）或通過內源性USP7的刪除阻斷（圖4G）。這些結果證明AMPK-DUBTAC以USP7依賴性方式穩定蛋白底物。為了與AMPK-DUBTAC穩定AMPKβ2中的作用保持一致，這些 DUBTAC 還導致Oil Red O染色評分降低，表明HeLa細胞中的脂質積累被破壞（圖4H）。此外，MS8655、MS8656 和 MS8657 處理減少了HeLa細胞的集落數量和集落大小（圖4I）。總之，這些結果表明，USP7可以用于生成AMPK DUBTACs，從而有效穩定AMPKβ2，激活AMPK信號傳導，減少腫瘤細胞生長。
?圖4. USP7 ligand #2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC穩定細胞中的AMPKβ2
本文基于USP7的非共價配體，開發了基于USP7的DUBTAC，其穩定ΔF508-CFTR突變蛋白與之前報道的基于OTUB1的DUBTAC具有相似的效果。重要的是，使用兩種不同的USP7非共價配體，開發了第一個AMPK DUBTAC，這些AMPK似乎可以選擇性地穩定AMPKβ的不同亞型，導致AMPK信號轉導升高。這些結果強調，除了OTUB1之外，USP7還可以用于開發DUBTAC，從而擴展了靶向蛋白質穩定和開發新型 AMPK DUBTAC 作為潛在療法的工具箱。
原文引用：
https://doi.org/10.1021/jacs.4c02373
責任編輯：LD
