分享的是一篇近期發表在期刊 JACS 上的文章。文章標題是“Sialylation Shields Glycoproteins from Oxidative Stress: Mechanistic Insights into Sialic Acid Oxidation and Structural Stability”，本文的通訊作者是來自南開大學化學學院的李功玉特聘研究員（研究方向：D-蛋白質譜分析）和付浩浩副研究（研究方向：分子模擬增強采樣算法和自由能計算）。
在本文中，作者通過一種微尺度低溫等離子體（microLTP）裝置，模擬了細胞中復雜的氧化應激環境，并結合高分辨率質譜分析（MS）和密度泛函理論（DFT）計算，首次完整繪制了兩種常見唾液酸（Neu5Ac 和 Neu5Gc）在自由基氧化條件下的氧化路徑圖。并進一步使用人轉鐵蛋白（hTF）作為模型，根據一系列 LC-MS/MS ?位點定位、唾液酸化特異性酶處理和 AIU-IM-MS 技術，確定了特定蛋白質的結構基序和唾液酸化模式。（Scheme 1）
microLTP 衍生的 ROS 的表征
優化研究表明，microLTP 處理時間和外部高壓功率幅度會顯著影響 ROS 的產生。在相同條件下，ROS 豐度順序為：H?O? > O?? > 1O? > ?OH。通過調控 microLTP 參數可生成特定濃度范圍的 ROS，為后續實驗確定了 ROS 生成的最佳條件。
唾液酸的深度自由基氧化
為了探究反應機理，作者計算了反應中間體的自由能（圖?1d-f），結果表明與不同量的 O? 反應時，會產生不同的穩定異構體產物和反應路徑。Neu5Ac 與 Neu5Gc 的羥基差異如圖?1g?所示，作者進一步測量了 Neu5Ac 與 Neu5Gc 的氧化動力學曲線，發現 Neu5Gc 因多一個羥基而表現出更強的抗氧化能力。
如?Scheme 2?所示，作者通過 microLTP 生成了 Neu5Ac 氧化的 46 種中間體和產物，包括側鏈氧化（步驟 I–III）和環斷裂（步驟 IV）的逐步路徑，并通過 DFT 計算和質譜驗證了各步驟的異構體及熱力學穩定性。
hTF 的唾液酸化依賴性結構穩定性
傳統 CIU 為 hTF 產生了不同的電荷態依賴性去折疊模式，當將數據集轉換為 AIU 模式（圖?2g）時，可以直接明確地比較具有不同處理的 6 個 hTF 樣本的去折疊行為。通過比較氧化后 hTF 的 CCS、AIU5 和 RMSD 數據，發現唾液酸化顯著提升了蛋白抗氧化的能力。
唾液酸化 hTF 的自由基氧化曲線
根據酶處理后的氧化水平變化，將鑒定出的肽分為兩類：上調（I）和下調（II）。I 組肽（如 47-60、531-541等）氧化水平顯著上調，對自由基氧化反應性更高；II 組肽（如 70-107、123-132等）氧化程度顯著降低（圖?3a）。從 hTF 的 3D 結構來看（圖?3b、c），I 組肽大多位于 C 端且靠近糖基化位點（Asn432 和 Asn630），說明糖基化可能對抵抗主鏈氧化有保護作用；而 II 組肽氧化水平降低可能是因為去除游離寡糖后結構重排造成的。這些結果進一步揭示了糖基化修飾和氧化作用在影響蛋白質結構穩定性方面的復雜相互作用。
圖?3. 受唾液酸化和?N-糖基化調節的 hTF 的自由基氧化曲線
隨后，作者還全面表征了在不同血漿處理時間下在 Asn432 和 Asn630 位點的糖型變化（圖?4c、d），發現有唾液酸化的糖在 Asn432 和 ?Asn630 位點隨時間增加而減少，且不同數量的唾液酸化糖型比例進一步證明了唾液酸化糖的氧化降解。
?綜上所述，本研究首次揭示了唾液酸化修飾在保護蛋白質結構和功能免受氧化應激損傷中的分子機制。這一發現不僅為理解糖基化在細胞應激中的作用提供了新的視角，還為開發更穩定的蛋白質藥物開辟了潛在的創新方向。
原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c14454
