化學(xué)合成法存在步驟多、收率低，需通過色譜純化來分離3Fax和3Feq異構(gòu)體等缺陷。由醛縮酶介導(dǎo)的化學(xué)酶法也存在反應(yīng)可逆、受熱力控制、需色譜純化異構(gòu)體等不足。于是，作者提出通過聯(lián)用唾液酸醛縮酶與CMP-唾液酸合成酶來捕獲3Fax的動(dòng)力學(xué)產(chǎn)物，并以60%的收率獲得了CMP-3FaxNeu5Ac(Scheme 1)。
化合物5在酸性條件下不能直接轉(zhuǎn)化成3，而是先生成7?(3Fax-Neu5Ac-2P)，然后經(jīng)堿性磷酸酶?(ALP)催化獲得目標(biāo)產(chǎn)物。為了量化F緩解5水解的程度，作者進(jìn)行了基于MS 的動(dòng)力學(xué)分析，分別將2和5水解成1和7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3位置的F取代使水解速率降低了約100倍（圖1）。
隨后，作者在U937細(xì)胞測試3a，發(fā)現(xiàn)它能有效降低Siglec-1, -2, -3, -5, -7, -8和-15的唾液酸聚糖配體水平（圖2）。
接下來，作者檢驗(yàn)動(dòng)力學(xué)捕獲方法能否有效獲得5的衍生物。如Scheme 2所示，作者通過級聯(lián)酶法順利獲得兼具光交聯(lián)基團(tuán)和點(diǎn)擊手柄的雙官能衍生物。相比之前的合成方法，該新型化學(xué)酶法，步驟少、產(chǎn)率高。
接下來，作者將光交聯(lián)探針11與三種人源重組的ST：ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4進(jìn)行UV交聯(lián)測試。首先，作者使用11與三種高濃度 (500 μM) 的ST進(jìn)行測試，觀察到11對ST6GAL1產(chǎn)生強(qiáng)的UV依賴性光交聯(lián)，對ST3GAL4有最弱的UV依賴性光交聯(lián)，且與ST3GAL1無光交聯(lián)。隨后，降低11的濃度，發(fā)現(xiàn)11對ST3GAL1有明顯的選擇性，甚至只需10 μM?11可實(shí)現(xiàn)與兩者的光交聯(lián)。當(dāng)增加CMP-Neu5Ac (2) 的濃度時(shí)，11對ST6GAL1活性位點(diǎn)的特異性會(huì)被競爭性抑制（圖3）。
最后，作者評估了化合物11和5對ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4的抑制強(qiáng)度和親和力。結(jié)果表明，與5相比，11對ST6GAL1的抑制力稍有增加；對ST3GAL4有相似的抑制強(qiáng)度；對ST3GAL1缺乏抑制效力。另一面，11與ST3GAL1的結(jié)合較差，與ST6GAL1, ST3GAL4有相似的結(jié)合強(qiáng)度（圖4）。
總之，作者報(bào)告了一種快速、精準(zhǔn)合成ST探針 (CMP-3FaxNeu5Ac) 的動(dòng)力學(xué)方法，并且驗(yàn)證了該方法可用于獲得C5, C9位置改造的探針，及其能實(shí)現(xiàn)不同ST間的選擇性交聯(lián)。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c10835
責(zé)任編輯：WXL
