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JACS.┃硫代-琥珀酰亞胺按需水解,用于組裝穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物2024-09-14

分享一篇近期發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上的文章,題目是“On-Demand Thio-Succinimide Hydrolysis for the Assembly of Stable Protein–Protein Conjugates”。文章的通訊作者為英國劍橋大學(xué)化學(xué)學(xué)院Gon?alo J. L. Bernardes教授。

蛋白質(zhì)偶聯(lián)物通過將兩種天然蛋白質(zhì)結(jié)合成單一支架,在生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域扮演著日益重要的角色。傳統(tǒng)上,這些偶聯(lián)物主要通過融合蛋白的重組表達獲得,但這種方法存在一些限制,如N-C末端連接的限制、錯誤折疊的風(fēng)險、低表達量以及組成蛋白系統(tǒng)的不相容性,這些問題阻礙了共表達。作為一種替代策略,翻譯后蛋白偶聯(lián)技術(shù)允許獨立表達的蛋白質(zhì)在翻譯后連接,這種方式不僅克服了N-C末端偶聯(lián)的限制,增加了拓撲多樣性,而且能夠在不同的宿主中產(chǎn)生不兼容的蛋白組分,使得一些難以通過傳統(tǒng)重組表達方式獲得的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物成為可能。這種翻譯后方法包括酶催化和基于標簽的技術(shù)、非天然氨基酸與生物正交反應(yīng)的結(jié)合,以及異雙功能和同雙功能化學(xué)連接策略,其中后者因其簡單的連接子合成和應(yīng)用廣泛而受到歡迎。

半胱氨酸殘基與馬來酰亞胺試劑的選擇性Michael加成反應(yīng)是生產(chǎn)蛋白-蛋白偶聯(lián)物相對可靠的反應(yīng)。然而,馬來酰亞胺的逆Michael解偶聯(lián)和隨后被內(nèi)源性硫醇捕獲導(dǎo)致所得偶聯(lián)物的降解,使得目前所使用的馬來酰亞胺試劑并不適用于產(chǎn)生穩(wěn)定可控的蛋白-蛋白偶聯(lián)物。作者認為雙馬來酰亞胺試劑在制備穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物時,必須滿足三個關(guān)鍵條件:(1)其與硫醇的反應(yīng)動力學(xué)需要與第一代馬來酰亞胺保持一致;(2)硫代琥珀酰亞胺的開環(huán)水解應(yīng)在幾分鐘到幾小時內(nèi)完成,以確保形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物;(3)未反應(yīng)的馬來酰亞胺應(yīng)最小程度或可控地開環(huán)水解為無反應(yīng)性的馬來酸。因此本研究開發(fā)了一種同源雙功能連接策略(圖1),以不易水解的馬來酰亞胺形式代替原本可以自水解的馬來酰亞胺,構(gòu)建復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物,從而滿足第一和第三個標準。在應(yīng)用外部觸發(fā)因素時,通過硫代琥珀酰亞胺的快速開環(huán)水解,所得偶聯(lián)物可以完全穩(wěn)定,從而滿足第二個標準。

 

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圖1.?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)中基于馬來酰亞胺的同型雙功能連接子策略概述。

 

研究首先確定了一種合適的自穩(wěn)定馬來酰亞胺來暫時抑制馬來酰亞胺水解,而僅在在施加外部刺激時觸發(fā)硫代琥珀酰亞胺水解。由于硫代琥珀酰亞胺附近的質(zhì)子化胺的感應(yīng)吸電子效應(yīng)是加速水解的主要驅(qū)動力,因此考察了將氨基保護來暫時抑制水解。通過對馬來酰亞胺衍生物1,2,3(圖2)對比,得出對硫代琥珀酰亞胺附近的酰胺鍵的吸電子作用促進水解,另一方面,羧基陰離子(馬來酰亞胺3)具有抑制水解的電子供體效應(yīng),提高了馬來酰亞胺衍生物的穩(wěn)定性。

 

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圖2.?馬來酰亞胺1-3的一般結(jié)構(gòu)和通過HPLC檢測的其水解動力學(xué)。

 

由于酰胺基團是一種促進水解的取代基,因此很明顯,消除其效應(yīng)是最小化預(yù)共軛水解的關(guān)鍵。為了解決這個問題,我們用氨基甲酸酯保護的仲胺合成了一種替代馬來酰亞胺衍生物,與馬來酰亞胺氮(馬來酰亞胺4)相距兩碳(圖3a)。在相同條件下,馬來酰亞胺?4?在?8?小時后水解率低于?10%(圖?3a)有了足夠穩(wěn)定的馬來酰亞胺,我們假設(shè)馬來酰亞胺?4?的衍生物可以使用不穩(wěn)定的保護基團暫時掩蓋。使用生物偶聯(lián)相容的觸發(fā)器,設(shè)想可以隨后去除氨基甲酸酯,從而揭示出一個吸電子的仲胺基團。為了探索這一點,合成了馬來酰亞胺?5、6?和?7,分別具有化學(xué)、光化學(xué)和酶促脫保護觸發(fā)器。發(fā)現(xiàn)所有三個氨基甲酸酯基團都賦予馬來酰亞胺與4一致的穩(wěn)定性,在相同條件下(pH 7.0,NaP我,20mM,25°C)(圖3a)。馬來酰亞胺5–7與含半胱氨酸的五肽(Ac-LVCAF-NH2)進行反應(yīng),并通過HPLC-MS評估胺脫保護和硫代琥珀酰亞胺水解率。實驗中,源自馬來酰亞胺5的肽基-硫代-琥珀酰亞胺含有一個二硫鍵,在加入TCEP后,通過硫醇酯環(huán)化啟動胺脫保護(圖3 b)。進一步由5和6衍生合成了同源雙功能的雙馬來酰亞胺試劑(圖3 c)。

 

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圖3.?按需水解馬來酰亞胺衍生物結(jié)構(gòu)及雙功能化馬來酰亞胺試劑

 

本文選擇了PD-L1和HER2作為與插入在C端區(qū)域的游離半胱氨酸殘基反應(yīng)形成同源(圖4 a, b)和異源(圖4 c)二聚化方案的模型蛋白,通過實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)合產(chǎn)生的二聚體的功能大于其組成部分。

 

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圖4.?同源和異源二聚化方案示意圖。

 

同時,三聚及四聚體的組裝也被證實是有效的(圖5 a)。其次,基于光催化脫保護的馬來酰亞胺?6?的同型雙功能連接子通過組裝得到穩(wěn)定的?IgG/sdAb?抗?HER2/PD-L1?雙特異性構(gòu)建體進一步證明了適用性(圖5 b)。

 

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圖5.?蛋白三聚/四聚體構(gòu)建和雙特異性抗體構(gòu)建示意圖。

 

綜上所示,按需水解馬來酰亞胺提供了一種強大的化學(xué)驅(qū)動翻譯后蛋白-蛋白偶聯(lián)方法,既克服了蛋白-蛋白偶聯(lián)問題,又能完全控制馬來酰亞胺和硫代琥珀酰亞胺的穩(wěn)定性。雙馬來酰亞胺試劑在合成穩(wěn)定的蛋白-蛋白偶聯(lián)物中有很大的潛力。

原文鏈接:https://testpubschina.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03721

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