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為大家分享一篇發表在JACS上的文章Stapled β?Hairpins Featuring 4?Mercaptoproline，通訊作者是來自美國Tufts大學的Joshua A.Kritzer教授，他的研究方向主要是蛋白靶向肽及其模擬物的設計、篩選和開發。

限制性多肽是蛋白質配體的豐富來源，往往能以高親和力和特異性結合到蛋白表面，但許多用于發現限制性多肽的方法難以運用到非蛋白性氨基酸和化學交聯上，而計算設計可能是一條更直接的途徑。在本文中，作者描述了由四個非蛋白性氨基酸組成的β-發夾的計算設計，并通過新的分子內交聯進一步穩定。

此前，Timmerman等人開創了“CLIPS”反應，通過二溴甲苯進行半胱氨酸的烷基化，從而穩定環和α-螺旋結構，此方法也適用于D-Cys、homo-Cys、青霉胺等。作者設想使用相同的化學物質來裝訂4-巰基脯氨酸(4MP)。4MP是羥脯氨酸的類似物，先前被用于天然化學連接和研究脯氨酸構象。相比于Cys，4MP具有更強的扭轉剛性和多達四種可用的立體異構體來改變staple的幾何形狀。由于脯氨酸對于β-turns結構至關重要，作者選擇β-hairpin多肽HP7作為模型系統來研究4MP的裝訂。

先前的計算方法往往通過設計具有良好折疊的二級結構支架，然后將二硫鍵嫁接到已經設計的支架上，但這種策略對4MP等非天然氨基酸以及cross-linker的采樣效果不佳；在本文中，作者采取了一種新思路：通過對各種裝訂形式進行系統建模，來找到那些兼容特定二級結構的staple，并將剩余肽段嫁接到staple上。作者使用RDKit為4MP的兩種立體異構體、CLIPS反應交聯劑以及Cys/homo-Cys所有可能的排列生成大量構象，并進行能量最小化。隨后，在29個具有晶體結構的β-turns模板庫中進行搜索，發現設計的staple與含有D-Pro和Acpc的β-turns匹配地很好，將這兩個轉角殘基嫁接到設計的staple上即形成了裝訂的β-turn。最后，將裝訂的β-turn引入β-hairpin模式序列HP7，發現4MP的引入導致典型發夾結構被破壞，但在4MP的對側引入D型氨基酸即可允許β-hairpin的延伸。總得來說，完整的β-hairpin序列包括設計的staple，連接的β-turn，引入的D-氨基酸以及HP7序列中的反平行β-strands。最終，進行一輪側鏈設計，得到新序列4MP-m以及未裝訂的4MP-a。

后續對4MP-m和4MP-a的一系列實驗表明，裝訂后的β-hairpin相比于模式序列HP7在圓二色譜中表現出更結構化的特征。盡管裝訂并未顯著增強熱穩定性，但細胞實驗顯示裝訂后的β-hairpin可以很好地抵抗蛋白酶的降解，并具有中等程度的細胞滲透性，且在30uM以內均未觀察到細胞毒性。

總之，作者提供了一種新的計算方法，可運用于各種裝訂類型和二級結構的設計。此外，作者還展示了4-巰基脯氨酸作為訂書肽組分的可行性。由于脯氨酸是包括β-hairpin在內若干二級結構的促進殘基，作者預計4MP等新型殘基的引入還能為藥物開發提供更多獨特的支架。