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三乙酸內酯（TAL）是生物工程的重要產品（圖1A），它是諸多商業化學品和藥物的關鍵前體。在代謝工程領域，TAL的產量已經獲得很大提升，但催化TAL生成的關鍵酶2-吡喃酮合酶（2PS，圖1B）對底物丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）的催化效率僅有大約10²?M^-1s^-1，遠低于其他次生代謝酶的平均性能。以往文獻報道中也有通過蛋白質工程改造2PS的工作，但仍缺乏系統性，活性位點周圍還有很大改進空間。定向進化是較好的研究方案，但缺乏高效的方法對大量改造菌株的產量進行精準檢測。

圖1: A) TAL及其轉化物的應用-藍色標記的分子可用作食品添加劑、芳香劑等，紅色標記的分子可用作基礎合成原料；B) 2PS晶體結構；C)?成像質譜高通量定量流程

為進一步優化2PS效能，德克薩斯大學奧斯汀分校Lu Yi教授團隊與伊利諾伊大學香檳分校Jonathan V. Sweedler教授合作，在之前對2PS蛋白質工程的研究基礎上?(Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.202212440)，基于體內/體外酶催化活性關聯對2PS進行了系統性的蛋白質工程改造，并采用高通量成像質譜方法（圖1C，Anal. Chem., DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04845）對TAL的產量進行快速定量（1分鐘/樣品）。

通過多輪定向進化，團隊成功獲得優質2PS改造酶。其中L202G/G205S/M259L/L261C-2PS在大腸桿菌中的TAL產量比野生型高46倍、比報道過的最佳2PS突變型（L202G/L261N-2PS）高2.5倍；另一突變型L202G/L261C-2PS的催化效率(k_cat)比野生型高44倍，比L202G/L261N-2PS高1.5倍（圖2A）。

通過測定米氏常數，作者發現L202G/L261C-2PS的催化效率雖然最高，但對底物malonyl-CoA的親和力低。相比于L202G/G205S/M259L/L261C-2PS，它的低產量表明了酶和底物親和力對代謝反應的影響。作者利用合成生物學轉化了一條額外的代謝途徑，使大腸桿菌能夠通過丙二酸生成更多的malonyl-CoA。作者驚奇地發現，當malonyl-CoA濃度提高約三倍時，最優產量的突變型從L202G/G205S/M259L/L261C-2PS變成了擁有更快反應速率的L202G/L261C-2PS。這一現象顯著地展現了體內/體外的蛋白質工程的差異，并且強調了正確的選擇壓力的重要性。值得注意的是，這種細胞內的選擇壓力通常很難通過體外實驗環境去模擬，因為像malonyl-CoA這樣的中心代謝物在體內會持續生成、高度調控并且維持在特定的濃度。

圖2：A）關鍵變種的產量對比；B）?關鍵突變型的米式方程，MatB/C途徑用于合成malonyl-CoA。

本文作者將蛋白工程與高通量篩選相結合，系統性地研究分析了體內/體外酶催化性能的差異，并獲得了兩個2PS的高效突變體，表現出44倍以上的k_cat、25倍以上的催化效率和46倍以上的TAL產量。這一工作流程可以應用于其他天然產物的蛋白質工程和合成生物學的研究。

論文信息

Enhancing 2-Pyrone Synthase Efficiency by High-Throughput Mass-Spectrometric Quantification and In?Vitro/In?Vivo Catalytic Performance Correlation

Yu Zhou,?Shuaizhen Zhou,?Scott Lyons,?Haoran Sun,?Prof. Jonathan V. Sweedler,?Prof. Yi Lu

ChemBioChem

DOI:?10.1002/cbic.202300849

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