分享一篇發表在Chemical Science上的文章，題目為Chemotranscriptomic profiling with a thiamine monophosphate photoaffinity probe。文章的通訊作者為荷蘭Radboud大學的Willem A. Velema助理教授，其主要研究方向為核酸化學生物學和細菌耐藥性機制。
核糖開關（riboswitches）是一類扮演生物傳感器功能的非編碼RNA元件，它們在結合小分子代謝物后發生構象改變，從而調控轉錄或翻譯（Curr Biol. 2023; 33(9): R343-R348）。目前已知核糖開關結合的小分子通常具有扁平的雜芳環結構和帶電基團，以黃素單核苷酸（FMN）和焦磷酸硫胺素（TPP）等為代表。單磷酸硫胺素（TMP）是TPP生物合成的中間體，但其生理功能尚未知。近年來，通過光化學方法捕獲小分子-RNA結合事件顯示出了巨大的潛力，受此啟發，本文中作者設計通過光交聯探針在大腸桿菌（E. Coli）轉錄組中鑒定TMP結合的RNA。
首先，作者通過在TMP的噻唑鎓環甲基上引入光反應性基團（雙吖丙啶）和生物正交把手（炔基）構建了光交聯探針1。作者使用1與E. Coli的總RNA進行孵育，隨后使用紫外光進行光交聯，捕獲潛在的相互作用。經CuAAC反應富集后，通過下一代測序鑒定被富集的RNA（以DMSO為對照）。作者對這些富集得到的RNA進行了初步篩選，將目光集中在具有代謝物結合口袋特征的RNA上（>50 nts且具有5′ UTR），在此條件下注意到了三種轉錄本：rnpB、prs和ribB。隨后，作者通過RT-qPCR驗證了1對ribB具有顯著的富集，而對rnpB和prs沒有。值得注意的是，ribB此前分類為結合FMN（而非TMP）的核糖開關。作者通過對照探針、±UV和加入 FMN的競爭性實驗進一步證實了1對ribB FMN適配體部分的選擇性結合，提示這種FMN結合RNA很有可能也結合TMP。
為了確定ribB上的TMP結合位點，作者使用了逆轉錄終止測定法：RNA的逆轉錄會在與探針交聯的位置處終止。通過對所得的截短cDNA序列進行分析，作者鑒定到了 G115 和 G154 處的逆轉錄終止，這種逆轉錄終止依賴UV照射，且可以被 FMN競爭。這兩處位點都位于ribB的FMN適配體區域，作者也通過分子對接預測了TMP與該口袋的結合模式。
隨后，作者通過SHAPE（Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension）分析驗證了未修飾的TMP與ribB的結合。最后，作者使用體外轉錄/翻譯（IVTT）方法測試了TMP結合對ribB所調控的基因表達的影響。作者將螢火蟲熒光素酶基因連接到ribB 核糖開關的下游，通過報告基因表達的熒光信號讀出核糖開關的轉錄/翻譯調控變化。有趣的是，與已知配體FMN相反，TMP的結合增強了ribB下游基因的表達，可能具有一種獨特的結合和調控模式。
?總結而言，本文通過TMP衍生的光交聯探針，在大腸桿菌轉錄組中鑒定了潛在的TMP結合RNA，并將ribB鑒定為一種新的TMP結合RNA。
本文作者：TYC
責任編輯：MB
DOI：10.1039/D4SC06189F
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D4SC06189F
