分享一篇發表在Cell Chemical Biology上的文章，題目為“Antibiotic target discovery by integrated phenotypic and activity-based profiling of electrophilic fragments”，通訊作者是來自康奈爾大學分子化學與化學生物學系的Hening Lin教授和Mikail E. Abbasov教授，他們的研究方向分別是酶促翻譯后修飾以及化學蛋白質組學，Mikail E. Abbasov教授在博士及博士后期間師從Benjamin Cravatt教授。這篇文章中作者提出了一種發現抗生素靶標的方法，通過結合半胱氨酸反應性片段的競爭性ABPP方法與表型篩選方法來篩選靶標。
抗生素耐藥性是危及全世界的醫療問題。傳統的抗生素針對有限的幾種機制，比如細胞壁破壞、蛋白、核酸合成，因此，研究人員嘗試提出針對新的機制的抗生素，用來解決抗生素耐藥性問題。為了快速尋找新的抗生素靶點并開發先導化合物，作者篩選了半胱氨酸反應性化合物庫，通過尋找共價反應性的蛋白，從而擴大細菌蛋白質組中的可成藥的蛋白庫。作者應用了一個含有3200種共價配體片段的大型庫用于篩選，在金黃色葡萄球菌和霍亂弧菌中分別鑒定到48和17種化合物抑制細菌生長，然后排除了在HEK293T細胞中存在高毒性的11種化合物。這其中，氯甲基酮彈頭表現出低細胞毒性和較強的抑菌能力。作者選定了帶有氯甲基酮彈頭的化合物10-F05作為先導化合物，因為它表現出對多種細菌的廣譜抗菌效果。
作者發現10-F05可以對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有良好的殺菌效果，細菌對其產生耐藥性比傳統抗生素要慢很多，且與其他抗生素沒有交叉耐藥的行為。這說明10-F05可能存在新作用機制。
作者使用競爭性ABPP策略尋找10-F05的靶標。在福氏鏈球菌中鑒定到588種蛋白的1035個半胱氨酸，數據庫預測其中103種是該細菌必需的。在這些靶標中，作者關注到FabH，MiaA和PdxY蛋白，所鑒定到的半胱氨酸位點均參與重要的生物過程，包括脂肪酸生物合成，tRNA修飾及磷酸吡哆醛挽救。作者純化了這幾種蛋白，證明10-F05可以競爭掉IA熒光探針的信號，支持10-F05修飾在半胱氨酸上。
接下來，作者進一步研究了這幾種靶蛋白對抗菌的作用。對于FabH，這是一種已知的抑菌靶點，所鑒定到的C112位點是保守的催化位點。作者用它的抑制劑處理細菌，發現細菌的生存與10-F05相似，說明10-F05抑制了FabH導致細菌死亡。作者還利用過表達和敲除實驗進行證明，結果顯示過表達相關蛋白后，細菌對10-F05更不敏感，反之亦然，說明這些蛋白在殺菌過程中起到關鍵作用。其中YiiD蛋白參與了繞過FabH抑制的通路，因此它的過表達使FabH被10-F05抑制的事件更不致命了。
對于MiaA，作者鑒定到的C273位點位于tRNA結合位點附近，預測共價對接結構顯示10-F05修飾可能干擾tRNA結合。實驗驗證加入10-F05后游離tRNA的確增多了。并且10-F05處理使MiaA酶活降低了（圖5E）。作者進一步通過實驗證明了MiaA的抑制導致翻譯錯誤率增加（圖6B），并且導致細菌的抗逆性變差。
?總之，本文作者提出了一種發現抗生素靶標的方法，通過結合半胱氨酸反應性片段的競爭性ABPP方法與表型篩選方法來篩選靶標。作者發現FabH和MiaA是片段10-F05的主要靶標。作者驗證了FabH的共價C112修飾和MiaA的C273修飾在抗菌過程中發揮重要作用。
本文作者：WYJ
責任編輯：WYQ
DOI：10.1016/j.chembiol.2025.02.001
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.02.001
