分享一篇發表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的標題為“De novo designed Hsp70 activator dissolves intracellular condensates”，本文的通訊作者分別是來自華盛頓大學的Jason Z. Zhang和David Baker教授。
熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，Hsp70）是蛋白質量控制（Protein Quality Control，PQC）的重要組成部分，通過與伴侶蛋白J-domain protein（JDP）相互作用引發構象變化，激活其ATP水解酶活性，從而招募多種客戶蛋白，在蛋白折疊、轉運以及周轉中起到關鍵作用。近年來，細胞內凝聚體已被發現對細胞的信號轉導和基因表達其調控作用，但是其機理尚未完全明晰。因此，本文從頭設計了一系列人工蛋白J-domain mimics（JDMs），調節Hsp70的活性，研究其如何影響凝聚體的溶解，進而調控cAMP/PKA信號通路，揭示其在細胞生長和信號調控中的作用。
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首先，作者依據先前研究報道的“DnaJB1與RIα相互作用能夠減少RIα凝聚顆粒的數目”，構建了包含熒光基團mCherry、GFP抗體GFP nanobody以及DnaJB1的J-domain（JD）的“凝聚體擾動器”結構。將其與RIα-GFP在HEK293T細胞中共表達，作者發現相較于對照組其凝聚體顆粒數目顯著下降，表明擾動器的成功靶向。考慮到天然JD與Hsp70的結合能力較弱，作者猜測設計結合能力更強的JDM能夠提升對凝聚體的溶解能力。因此，作者采用兩種策略，利用Rosetta和AlphaFold2設計了新的JDMs：1）從頭設計具有相同結合位點但不具備相似結構和序列的JDMs， 2）結合DnaJ中與Hsp70相互作用的兩個螺旋，設計第三個螺旋以提升結合能力和穩定性。最終他們篩選出41種能夠有效結合Hsp70的JDMs。
接下來，作者通過ATP周轉實驗驗證JDMs能否激活Hsp70的ATP水解酶活性，溶解凝聚體或促進目標蛋白的折疊，并獲得了具有激活作用的JDM37以及抑制作用的JDM16。通過添加Hsp70抑制劑VER-155008，凝聚體溶解效果消失，共同驗證了JDM37的激活作用。此外，他們還將JDM37應用于溶解其他的內源凝聚體，例如paraspeckle，利用CRISPR-Cas9系統在NONO、PSPC1、SFPQ等paraspeckle相關蛋白中插入GFP標簽，通過相似的JDM37凝聚體擾動器驗證其對于paraspeckle的影響。
然后，作者進一步將JDM用于探究凝聚體的信號轉導過程。他們利用ICUE3和AKAR4傳感器，確定在JDM37激活Hsp70并溶解凝聚體后，細胞內的cAMP水平顯著升高，并且PKA活性得到增強。這表明JDM37通過溶解RIα凝聚體，促進了cAMP/PKA信號通路的激活。
最后他們還將JDM37用于研究與肺癌相關的蛋白EML4-Alk形成的凝聚體，并發現JDM37凝聚體擾動器能夠溶解這些癌癥蛋白凝聚體，降低Ras/Erk信號通路活性，并抑制細胞生長速度。
總的來說，本文通過從頭設計Hsp70激動劑，發展了一種調控細胞內凝聚體的策略，為理解凝聚體在信號通路中的作用提供幫助。
本文作者：CJJ
責任編輯：LYC
DOI：10.1016/j.chembiol.2025.01.006
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.01.006
