分享一篇發表在Angew上的文章，題目為“Core-Shell Reactor Partitioning Enzyme and Prodrug by ZIF-8for NADPH-Sensitive In Situ Prodrug Activation”。?文章的通訊作者是來自中國藥科大學藥品質量控制與藥物警戒教育部重點實驗室的丁婭教授，其主要方向：細胞膜工程化用于腫瘤治療、金屬有機骨架用于核酸標志物檢測和腫瘤治療、mRNA疫苗的跨膜遞送。
細胞色素P450 (CYP450)是肝微粒體系統的主要組成部分，也是大多數前藥的特異性代謝酶，由于CYP450在肝臟中高表達，所以通常在肝臟前藥轉化，形成的活性藥物通過體循環到達癥狀部位。這一過程導致嚴重的肝毒性和潛在的全身毒性，此外，CYP450易受外源性藥物或環境因素的影響，表現出個體異質性。因此，實現酶和前藥的時空調控，維持甚至提高靶位點酶的活性是具有挑戰性的，但也具有重要意義。
由有機配體和金屬節點(離子或納米團簇)組裝而成的金屬有機骨架(MOF)是具有超大比表面積的多孔網狀材料，它們不僅可以保護酶的結構和活性，而且在酶在特定位點的傳遞中作為載體發揮重要作用。為了實現酶和前藥在腫瘤中的共定位，將酶和前藥分別包封在ZIF-8和PCN-333(AL)中。然而，MOF基材料的載藥量(DLC)通常小于15%，由于固定化酶的持續催化能力，使前藥在原位耗竭會限制酶活化效率。最近，作者提出使用前藥作為有機配體直接構建MOF，稱為PROMFS。該方法通過與金屬節點的相互作用提高了藥物穩定性，而且將DLC顯著提高到66.4%。然而，由于大多數前藥的結構對稱性較低，因此所得的PRO – MOF具有許多結構缺陷。有報道稱，具有結構缺陷的MOF可能更有利于提高酶的催化效率，但這些MOF容易導致酶的漏失和催化反應的提前發生。因此，在保持酶活性的同時增加系統中前藥的比例是MOF固定化酶-前藥治療的關鍵問題。
為了解決(1)酶和前藥的時空控制，(2)維持甚至提高酶的活性，(3)前藥在靶位點的原位耗用等問題，作者提出了一種新型的核-殼反應器，通過沸石咪唑酸框架(ZIF-8)分配酶和前藥。首先將CYP450固定在ZIF-8中，然后抗惡性黑色素瘤前藥達卡巴嗪(DTIC)沉積在ZIF-8外層，DTIC作為表面配體可增加DLC。這種獨特的核殼結構將酶及其前藥底物整合和分割在一個顆粒中，且該堆殼反應器在生理環境中具有較高的穩定性。反應器被腫瘤細胞吸收后，在溶酶體酸性條件下降解后釋放帶正電荷的2-甲基咪唑(2-MIM)和DTIC，通過質子海綿效應幫助溶酶體逃逸CYP450。有趣的是，CYP450在反應器中的催化活性只能在腫瘤細胞細胞質中存在高濃度的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)時發揮作用，將DTIC轉化為甲基陽離子(方案1B和1c)這些甲基陽離子誘導DNA甲基化和隨后的腫瘤細胞凋亡(方案1B)利用透明質酸的腫瘤靶向能力，核殼酶反應器在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中顯示出較高的腫瘤抑制率。
方案1
ZIF-8@DTIC (ZD)的制備與表征
為了制備核殼酶反應器，首先將Zn2+與2-MIM配位制備ZIF-8，并使用了四種含五元氮雜環基團的藥物，作為前藥在ZIF-8上構建外殼，包括DTIC(方案1C)、替莫唑胺、來曲唑和6-硫鳥嘌呤(圖1A)參與隨后的配位過程。在這些藥物中，只有DTIC能夠協同作用于ZIF-8的外層。
加入DTIC配位后，ZIF-8的流體動力直徑從110.4 ~ 3.7 nm到176.4 ~ 1.6 nm(圖1B)，但zeta電位幾乎沒有變化(圖1C)。TEM和?SEM圖像顯示，ZIF-8形貌由十二面體變為球形。?EDX成像表明表面Zn和N元素的均勻分布高度相關(圖1F)，表明Zn2+均勻分布在整個顆粒中。而羰基DTIC中O元素主要分布在粒子的外層，表現出含的ZD殼層分布。且ZD的殼結構不受Zn2+濃度的影響，即使沒有額外的鋅離子加入也會形成殼，作者推測殼的形成涉及Zn2+和DTIC之間的配位作用。
為了闡明核殼反應器的形成機理和外層結構，測定了甲醇浸泡前后ZD的?XRD譜圖。作者發現ZD不僅保持了ZIF-8的晶體結構，而且出現了新的衍射峰，這一發現表明，在ZD的骨架結構中摻雜了少量的DTIC晶體。相比之下，用甲醇浸泡和洗滌的ZD樣品只顯示出與ZIF-8相似的XRD模式，盡管大部分DTIC仍保持在MOF結構中(藍色虛線，圖1G)。這些結果表明，該反應器是由ZIF-8核和由Zn-DTIC配位化合物組成的雜化殼組成的核殼結構。然而，ZD的殼層不是均勻的MOF結構，而是由配位DTIC和沉積DTIC組成，HPLC分析顯示，它們的比例分別為71.6%和28.4%。因此，這種獨特的結構賦予了ZD極高的DLC，這可以歸因于Zn2+與DTIC.的配位作用，FITC表明DTIC中咪唑環、羰基和酰胺基參與了與Zn2+的配位作用。
圖1
CYP450負載ZIF-8@DTIC (CZD)的制備、表征及體外特性
為了實現原位藥前激活，作者采用一鍋法將CYP450包封在ZIF-8中(記為CZ)。增加進料液中CYP450的濃度會導致CZ的水動力直徑增加。然而，CZ的zeta電位幾乎沒有變化，這表明CYP450被包裹在ZIF-8中而不是在其表面。SDS-PAGE分析顯示，在ZIF-8的框架中，CYP450的完整結構被保留。當投CYP450為100 μg/mL時，CZ上清中未檢測到游離蛋白，蛋白負載效率(PLE)幾乎為100%。通過BCA分析確定CZ的蛋白質負載能力(PLC)為1.1 ~ 0.1%(圖2C-2E)。隨后，2-MIM被解離，DTIC與CZ的殼結合得到CZD。與ZD的制備類似，CZ保留了ZIF-8的十二面體形態(圖2A)，但加入DTIC后CZD的形狀變為球形(圖2B)。采用?(BET)測量法估算CZ和CZD的表面積。CZD對N2氣體具有明顯的I型吸附，?DTIC配位在CZD外層產生了一些孔洞和微孔，這可能是導致CZD比表面積和孔體積增大的原因BCA法測定CZD的PLC為0.85±0.02%(圖2C-2E)，HPLC法測定其DLC為40.9±4.9%。對CZD的上清進行BCA測定，結果表明在成殼過程中沒有蛋白滲漏。
通過監測流體動力直徑的變化，評估了CZD在不同介質中的穩定性(圖2G)。作者發現CZD在PBS (0.03 M和0.2 M, pH 7.4)和細胞培養基中表現出良好的尺寸穩定性?(圖2F和2G)。在pH 7.4的0.03 M PBS中浸泡48 h后，CZD保持完整的晶體結構，形貌略有變化，?Zn-DTIC外殼的穩定性維持了CZD的形態，避免了pH 7.4下PBS中藥物和酶的泄漏(圖2H和2I)。然而，當顆粒浸泡在pH為5.5的0.03 M PBS中時，由于顆粒分解和殘余結構聚集(圖2G)，懸浮液很快變得清晰(圖2F)。為了研究CZD中DTIC和CYP450的釋放情況，將樣品浸泡在pH 7.4和5.5的PBS中48小時(圖2H和2I)。DTIC和CYP450在pH 7.4時釋放緩慢，而在pH 5.5時釋放迅速，表明MOF結構在生理環境中具有較高的穩定性，但在腫瘤或溶酶體酸性環境中會發生結構解離。還發現DTIC的釋放速度比CYP450快。在pH 5.5條件下24小時內，分布在殼內的DTIC有87%被釋放(圖2H)，而在pH 5.5條件下孵育36小時后，包封在核心內的CYP450只有80%被釋放(圖2I)。
圖2
腫瘤細胞中NADPH敏感的前藥激活
為了原位驗證CZD在腫瘤細胞中持續的藥物生產能力，在孵育24小時后檢測了CZD對多種細胞的細胞毒性，?CZD對所有腫瘤細胞（B16-F10；HepG2；MDA-MB-231）都表現出明顯的細胞毒性，其中B16-F10細胞比其他細胞更敏感(圖4A)。為了揭示CZD對B16-F10細胞的選擇性，作者測定了NADPH/NADP+比值，并與正常人肝細胞(L02)和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)進行了比較。作者發現B16-F10細胞的NADPH/NADP+比值比L02細胞和HUVECs高1.5倍以上，這可能導致了不同的前藥激活作用(圖4B)。與DTIC、CZ和ZD相比，只有CZD對B16-F10細胞表現出劑量依賴性的細胞毒性(IC50為26.3 ~ 2.6 μg/mL)，而對L02和HUVECs的影響較小(圖4C)。同樣，共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察到的細胞活/死染色也證實了DTIC的激活導致細胞死亡(圖4D)。
為了揭示酶反應器的細胞攝取機制和細胞內催化過程，作者將FITC加載到ZD中，取代CYP450，得到FITC負載的ZD (FZD)。首先用氯丙嗪、染料木素和wortmannin等各種抑制劑對B16-F10細胞進行預處理和不預處理，并通過流式細胞術分析測量FZD的細胞攝取(圖4F)。染料木素和wortmannin對FZD的細胞攝取沒有明顯的影響，而氯丙嗪對FZD攝取的抑制作用超過50%(圖4G)，表明了網格蛋白介導的內吞機制根據DTIC的藥理機制，通過CYP450代謝為CH3 +并使細胞核中的DNA甲基化。為了在細胞中證實這一過程，FZD被用來跟蹤酶反應器的細胞分布。CLSM觀察(圖4H)：在B16-F10細胞中，培養4 h后FITC的綠色熒光與LysoTracker的紅色熒光有很好的重疊，這與作者前面論證的網格蛋白介導的內吞機制一致。在新鮮培養基中再孵育8 h后，綠色熒光擴散到細胞質中，溶酶體難以染色(圖4H為12 h)。這一發現表明溶酶體的逃逸和破裂是由于含有咪唑基團的DTIC和2-MIM的質子海綿效應。
圖3
體內腫瘤靶向性、治療有效性及安全性
為了研究核殼酶反應器的抗腫瘤作用，作者采用C57BL/6 J小鼠原位植入建立B16-F10黑色素瘤小鼠模型。每2天靜脈注射生理鹽水、游離DTIC、ZDH、CZD和CZDH (圖5A)。與游離DTIC相比，ZDH對腫瘤的抑制作用最低，僅次于生理鹽水(圖5B和5c)。這表明大多數藥物可以通過HA靶向腫瘤組織。值得注意的是，與其他制劑相比，用CZDH治療組的相對腫瘤體積(RTV)明顯受到抑制(圖5B和5c)，第14天，CZDH組的腫瘤重量也是其他組中最低的(圖5D)。值得注意的是，在治療的第6天，該組有3個腫瘤消失，這說明了CZDH反應器的良好治療效果。同時，CZDH組的毒性也最低。CZDH組小鼠體重的輕微變化(圖5E)和最高的存活率(100%，圖5F)表明其具有優越的安全性
這種提高的抗腫瘤療效和生物安全性可能是由于精確的腫瘤位置的反應器。因此，通過HPLC和電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)方法，在靜脈注射后不同時間檢測反應器的體內生物分布，如DTIC和Zn2+在正常器官和腫瘤中的含量。在被動靶向CZD的基礎上，腫瘤中的DTIC水平(8 h時為1.36 ~ 0.72 μg/g)高于其他器官。這種精確的CZDH蓄積使藥物在肝臟中的分布最小化，同時增加了腫瘤蓄積，這證實了體內生物催化更有效、選擇性和安全性。腫瘤組織進行組織學分析，H&E和TUNEL染色均顯示，czd處理組腫瘤組織出現腫瘤壞死和凋亡，但壞死和凋亡細胞密度明顯低于CZDH處理組(圖5G)。
圖4
總之，作者提出了一種新的核殼CYP450反應器。該結構由一個ZIF-8核心和一個Zn-DTIC框架外殼組成。CYP450反應器在黑色素瘤治療的有效性、選擇性和生物安全性方面具有若干優勢。該反應器允許在腫瘤細胞內同步遞送CYP450及其底物DTIC。CYP450在核殼結構的保護下能夠維持其催化活性。CYP450反應器被腫瘤細胞內化后，它們通過含咪唑環配體介導的質子海綿效應從溶酶體中逃逸。腫瘤細胞中NADPH/NADP+比值較高，這可能是反應器選擇性激活抑制細胞增殖的原因。此外，CYP450反應器的高載藥能力可以保證前藥在腫瘤細胞中的持續活化。最后，CYP450反應器在B16-F10荷瘤小鼠模型中顯示出良好的抑制生長和增殖的能力，副作用可以忽略不計。因此，這種核殼反應器為處理作者在酶前藥物治療領域遇到的幾乎所有問題和豐富基于ZIF-8的生物學應用提供了一種新穎而直接的策略此外，這種納米反應器也提供了前景，在治療癌癥或其他需要酶代謝藥物的疾病方面具有很大的潛力。
本文作者：WQY
責任編輯：LRC
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37881154/
DOI：10.1002/anie.202314025
