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分享一篇發表在Angew上的文章“A Bioorthogonal Dual Fluorogenic Probe for the Live-Cell Monitoring of Nutrient Uptake by Mammalian Cells”，通訊作者是萊頓大學的Sander van Kasteren教授，他們課題組主要利用化學工具研究早期免疫反應。這篇文章設計了一種可通過生物正交反應激活的熒光探針，用于研究細胞對代謝物分子的攝取。

免疫細胞在激活后可通過增加對營養物質的攝取用于細胞的合成代謝及供能，對這種攝取過程的研究可通過同位素或熒光標記等方式來實現，其中同位素標記的方式操作復雜且無法實現單細胞水平的觀測，直接對代謝物進行熒光標記則往往影響了其本身的細胞攝取速率。本文作者此前開發了一種通過炔基-疊氮點擊化學反應來對代謝物進行標記和成像的方法，但由于這種點擊化學反應無法直接用于活細胞，需要對細胞進行事先的固定，因此本文中作者希望通過活細胞適用的逆電子需求的DA反應（IEDDA）進行標記和成像。

作者以常用的熒光分子CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）為基礎進行設計，CFSE結構中的兩個乙酸酯可以增加其透膜性并同時保證只有熒光分子進入細胞內并被酯酶切割后才能具有熒光，NHS酯部分則能夠通過與賴氨酸殘基反應將熒光分子固定到蛋白上。作者通過在CFSE的結構基礎上引入了四嗪基團，從而額外引入了一層激活機制，即只有四嗪與烯烴發生IEDDA反應后才能夠激活熒光，進而實現對目標代謝物的成像。

作者對合成的熒光探針進行表征，使用豬肝酯酶處理后探針的熒光信號增強了6倍，在此基礎上再加入TCO（反式環辛烯）則能夠使熒光信號增強20倍，說明熒光探針能夠按照預想中的方式被激活。隨后作者構建了一個小型的含烯烴化合物庫，包括TCO衍生的氨基酸，糖，以及環丙烯衍生的脂肪酸，谷氨酸等，測試發現TCO衍生物與探針均能夠在25min內完成反應，環丙烯衍生物反應速率更慢，且環丙烯衍生的谷氨酸未能檢測到反應發生。

后續作者將探針用于活細胞成像，將細胞首先用探針孵育半小時，洗去探針后再加入TCO衍生的代謝物并進行成像，作者發現相同條件下細胞對糖衍生物有最高的攝取量。作為實際應用，作者使用CD3和CD28激活T細胞，并隨后加入TCO-氨基酸或環丙烯-脂肪酸來檢測兩種物質的攝取速率。他們發現只有在激活后的T細胞上檢測到了更快的脂肪酸衍生物攝取，而氨基酸衍生物的攝取則在激活前后差別不大，作者推測可能由于蘋果酸轉運蛋白在激活后表達水平上升。

總之，這篇文章通過設計一種可被生物正交代謝物激活的熒光探針，實現了活細胞水平上對生物正交代謝物的攝取速率進行檢測。

本文作者：LDY

責任編輯：WYQ

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202401733

文章引用：doi.org/10.1002/anie.202401733

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