分享一篇發表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，題目為“A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics ApproachProvides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4Substrates”，通訊作者是來自清華大學的尹航教授，其研究興趣是藥物發現，蛋白質工程和生物技術開發。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是一種參與多種生命活動的半胱氨酸型內肽酶。在非經典炎癥中，caspase4/5獨立于炎癥小體，直接被細胞內脂多糖激活，裂解gasdermin D (GSDMD)，導致多聚體N-GSDMD孔在細胞膜上組裝并釋放細胞溶質分子。然而對于caspase4的底物的有限理解限制了對其的進一步研究。本文結合遺傳密碼子擴展，光交聯和蛋白質組學，鑒定了caspase4的底物網絡。
Caspase4本身以無活性的酶原形式表達，在保守蛋白結構域p22和p10之間自切割后被激活，可以結合底物蛋白并顯示切割活性。于是作者為了鑒定caspase4的底物，將活性切割位點C258位突變為A，同時在p22和p10結構域直接添加HRV-3C切割位點，用于形成激活的Caspase4。最后還在底物口袋摻入非天然氨基酸pBpa，使用光交聯方法固定Caspase4和底物的相互作用。作者首先驗證了這種改造的探針可以維持天然構象與底物結合能力。
然后作者使用無標定量的蛋白質組學技術對+/-UV組在THP-1細胞裂解液中鑒定出156種潛在底物。為了驗證蛋白質組的鑒定結果，作者選取部分蛋白進行驗證，30個測試蛋白中有16個可以被有效切割。
?最后作者關注于AKT1蛋白，發現AKT1的切割位點位于D108，裂解位點D108正好位于PH結構域的末端，一個自我抑制和膜定位結構域的裂解可能會影響AKT1的激活或定位。作者還發現了Caspase-4對同家族蛋白酶Caspase-5/12前體的激活作用，揭示CASP4下游存在一個未知的復雜焦亡級聯。
總的來說，本文通過結合基因編碼擴展、光交聯和蛋白質組學，采用了一種獨立于蛋白水解的方法來分析caspase-4的底物。
本文作者：YDP
責任編輯：WYQ
DOI：10.1002/anie.202501535
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202501535
