在真核生物中，將非天然氨基酸（ncAAs）特異性插入蛋白質主要依賴于吡咯賴氨酸氨酰 tRNA 合成酶/tRNA 對。然而，為了擴大真核生物中 ncAAs 工具箱的結構多樣性，獲得更多的易于工程化的氨酰 tRNA 合成酶/tRNA 對，大腸桿菌來源的亮氨酸氨酰 tRNA 合成酶（EcLeuRS）/tRNA 對是非常有前景的替代方案。在這項研究中，通過優(yōu)化以酵母為基礎定向進化平臺，作者快速分離出許多新的 EcLeuRS 突變體，能夠在哺乳動物細胞中引入各種 ncAAs。
圖 1. 本文中使用的 ncAAs 結構
由于 EcLeuRS/tRNA 對來源于細菌，因此必須在真核體系中進行工程設計，避免其于與內源性對應物發(fā)生交叉反應。作者開發(fā)了一種基于酵母的定向進化系統，EcLeuRS/tRNAEcLeuCUA?對抑制 GAL4 轉錄因子中的 TAG 密碼子(GAL4-T44TAG-R110TAG; GAL4-2*)，驅動代謝報告基因如 URA3 或 HIS3 的表達（圖 2A）。這些報告基因的表達允許酵母在缺乏尿嘧啶（Ura）和組氨酸（His）的培養(yǎng)基中分別存活，從而選擇活性 EcLeuRS 突變體。該菌株包含 GAL4 驅動的?LacZ，以便通過藍白實驗進行下游篩選（正篩）。為了去除在缺乏?ncAA?底物的情況下仍保持活性的 EcLeuRS 突變體，使用負篩體系，通過表達 URA3 導致 5-氟乙酸（5-FOA）轉化為有毒代謝物，導致細胞死亡（圖 2A）。
為了對該篩選系統的性能進行測試，作者在酵母細胞中共表達 PLRS1 與其同源的 tRNACUAEcLeu?并測試了 ncAA Cap 的篩選情況。結果表明，盡管存在 Cap 的細胞生長更好，但在沒有 Cap 的情況下也觀察到大量意想不到的生長（圖 2B）。此外，不表達 EcLeuRS 的細胞（僅表達tRNAEcLeuCUA?進行篩選）在選擇條件下也顯示出殘留生長，表明了此系統的不嚴密性。作者進一步通過測量活性 EcLeuRS 突變體的富集水平來評估該篩選系統的性能。以 1:100 的比例混合兩種編碼 PLRS1 的質粒（活躍群體）或不編碼 EcLeuRS 的質粒（不活躍群體），對其進行篩選，通過 PCR 對存活的克隆進行單獨篩選，定量富集（圖 2E）。結果發(fā)現，這種選擇使活性與非活性群體的比例從 1:100 提升到約 1:1，表明約 100 倍富集。這種適度的富集水平可能不足以從大型突變文庫中輕松識別罕見的 ncAA 選擇性克隆，這解釋了過去需要使用多輪篩選的原因。作者猜想可以通過在某些位點引入額外的 TAG 終止密碼子從而抑制 GAL4-2* 的泄漏表達（圖 2C）。為了驗證這一猜想，作者在 GAL4-2* 的 5 個不同位置引入了第三個 TAG 密碼子，構建了 5 個 GAL4-3* 變體。結果表明，嚴密性得到了改善（圖 2D）。其中一個 GAL4-3* 突變體（GAL4-L3TAG-T44TAG-R110TAG）表現出最佳的存活模式，并能夠得到至少 1000 倍的篩選富集效果（圖 2E）。這些結果表明，與原始的 GAL4-2TAG 相比，基于 GAL4-3* ?的篩選系統能夠顯著提高 EcLeuRS 的定向進化效率。
為了測試 GAL4-3* 篩選系統對于定向進化工程化 EcLeuRS 的有效性，作者隨機選取其活性位點的 5 個關鍵殘基：M40、L41、Y499、Y527、H527構建了突變體文庫（圖 3A）。此外，在編輯結構域引入了一個 T252A 突變，該突變已被證明可以提高 ncAA 的插入效率。在將該文庫引入含有 GAL4-3* 選擇系統的酵母細胞后，作者在每輪篩選步驟后從酵母細胞中分離 EcLeuRS 編碼的 DNA，并在進行下一輪篩選之前將其轉化至新鮮宿主細胞中（圖 3B）。結果觀察到，僅經過三輪篩選（正-負-正），ncAA 選擇性突變體就能得到高效富集。對 10 個這樣的克隆進行測序，發(fā)現 7 個不同的 EcLeuRS 突變體具有相似的活性位點結構（圖 3C）。接下來，在哺乳動物細胞中共表達這些突變體與 tRNAEcLeuCUA，以測試它們將 Cap 插入到 EGFP-39-TAG 報告基因中的能力（圖 3C）。7 個突變體都促進了高效的 Cap 依賴的報告基因表達，證明篩選成功。
在驗證了篩選體系的可行性后，作者篩選了能夠有效插入 ONBC 2（一種瓜氨酸的光籠衍生物）的 EcLeuRS。
此前的研究發(fā)現，多特異性的 EcLeuRS 突變體 PLRS1 能夠偶然識別 ONBC，但效率很低。為了克服這一限制，作者使用優(yōu)化的篩選系統來開發(fā)一種高效的 ONBC 選擇性 EcLeuRS 突變體。在 3 輪篩選后得到了 7 個獨特的突變體，其中有 6 個促進了 HEK293T 細胞中 EGFP-39-TAG 報告基因的 ONBC 依賴性表達（圖 3D）。5 個突變體的活性明顯高于先前報道的 PLRS1，其中最好的兩個突變體提高了 4 倍活性。報告蛋白的 ESI-MS 進一步證實了 ONBC 的成功結合。在哺乳動物細胞中開發(fā)這種有效的瓜氨酸插入系統將有助于探索瓜氨酸化修飾在蛋白質組中的生理學作用。
圖 3. 使用優(yōu)化的系統篩選工程化 EcLeuRS
乙酰化和甲基化是哺乳動物細胞中賴氨酸的兩種主要翻譯后修飾。最近，Lu-Culligan 等人發(fā)現賴氨酸也可以同時乙酰化和甲基化，在組蛋白 4(H4)上形成新的 PTM，Nε–乙酰基-Nε-甲基賴氨酸（Kacme?3），并與轉錄起始水平升高有關（圖 4A）。這種新型 PTM 的生理作用尚不清楚，將其位點特異性地引入蛋白質將有助于闡明相關機制。作者合成得到了 Kacme，并利用此篩選系統來定向進化得到對應的 EcLeuRS。在 EcLeuRS 文庫中對 Kacme 進行三輪篩選（陽性、陰性、陽性）得到 5 個不同的突變體（圖 4B）。 HEK293T 細胞中，H1 和 EF9 表現出最高的活性（圖 4C， 4D）。利用 C 端 polyHis 標簽表達純化報告蛋白并進行 ESI-MS 檢測，結果驗證了 Kacme 的成功插入（圖 4E）。
最后，作者在 H4 的兩個內源性修飾位點（K5 和 K12）上特異性地引入了 Kacme。在 HEK293T 細胞中分別轉染編碼 H4-5-TAG 和 H4-12-TAG 基因的質粒，同時共轉染 EF9-EcLeuRS 和 tRNAEcLeuCUA?突變體 LeuIGI（圖 4F）。Western blot 分析顯示，只有在 Kacme 存在的情況下，全長 H4 才能成功表達（圖 4G）。
圖 4. 在哺乳動物細胞中基因編碼 Kacme
眾所周知，某些?aaRS?突變體是多特異性的，這意味著它們可以識別接受各種結構相似的 ncAA。這種多特異性的 aaRS 突變體是有價值的，因為它們可以方便地引入大量的 ncAA，無需進行長時間的定向進化實驗。作者懷疑本文報道的新的 EcLeuRS 突變體可能表現出顯著的多底物特異性。初步觀察表明，兩個特殊的 EcLeuRS 突變體 EF9 和 B11 有這種潛力。在 Cap 和 Kacme 篩選中都鑒定到了 EF9，而 B11 出現在 ONBC 篩選中。作者使用基于哺乳動物細胞的篩選策略，使用 EGFP-39-TAG 報告基因來探索 EF9 和 B11 是否可以識別插入各種線性脂肪族 ncAAs。兩個突變體都展現出非凡的多底物特異性，能夠插入的帶有多樣性化學功能基團的 ncAAs（圖 1, 圖 5A)，包括帶有化學偶聯基團的 TCO*K，帶有光交聯基團的 DiazK 和帶有 PTM 的 AcK 等。
鳥氨酸是一種豐富的非蛋白質源性氨基酸，也可以在多肽翻譯后由精氨酸殘基生成。這種較短的賴氨酸同源物與蛋白質的位點特異性結合為生物化學探針和蛋白質工程提供了獨特的機會。然而，假定的鳥氨酸- tRNA 復合物的化學不穩(wěn)定性，使得將其直接插入到蛋白質中具有挑戰(zhàn)性。作者猜想鳥氨酸的光籠化衍生物 ONBO?21?可以克服這一挑戰(zhàn)（圖 5B）。ONBO 與蛋白質共翻譯后，可以在光照下有效地轉化為鳥氨酸。此外，作者懷疑與 ONBC 結構相似的 ONBO 可能很容易被多特異性 B11-EcLeuRS 識別插入。作者化學合成了 ONBO，并驗證了這一假設，結果表明 B11-EcLeuRS 確實有效地將 ONBO 整合到 EGFP-39-TAG 中（圖 5A）。通過 ESI-MS 對純化得到得報告蛋白進行分析，證實了 ONBO 的有效插入，并進一步證明了光籠在照射后成功脫籠，在特定位點產生了鳥氨酸殘基（圖 5C）。
?圖 5. 兩個 EcLeuRS 突變體顯著的多底物特異性
原文引用：https://doi.org/10.1002/anie.202423172
責任編輯：WXL
