推薦一篇發表在Angewandte Chemie International Edition上的文章，文章標題是“Cyclopropenes as Chemical Reporters for Dual Bioorthogonal and Orthogonal Metabolic Labeling of DNA”。其通訊作者是卡爾斯魯厄理工學院的 Hans-Achim Wagenknecht 教授，致力于核酸化學、化學光催化、熒光DNA和RNA、DNA結構學。
在先前的研究中，作者已經成功地利用1-甲基環丙烯修飾的DNA通過IEDDA反應實現了標記。于是，作者希望在之前研究的基礎上實現DNA的雙重生物正交標記。之前的研究表明，甲基環丙烯的反應性會隨著甲基取代基的位置而改變，例如1-甲基環丙烯是應用于IEDDA反應的理想候選物，而3-甲基環丙烯的甲基基團會在IEDDA反應的過渡態中造成空間位阻，但卻可以與四唑原位產生的腈亞胺發生光點擊反應（圖1A）。基于這一理論，作者設計了一系列含有1-甲基環丙烯/3-甲基環丙烯的探針（圖1B），希望能夠通過IEDDA反應和光點擊反應實現DNA的雙重生物正交標記（圖1C）。
B：1-甲基環丙烯修飾的脫氧核糖核苷（1-5）用于IEDDA反應，3-甲基環丙烯修飾的脫氧核糖核苷（6-7）用于光點擊反應
C：結合IEDDA反應和光點擊反應對DNA進行雙重生物正交標記
B：用HPLC來分析探針1和6的正交反應性
C：b）、c）分別對應于修飾有Cy5的引物P1、成功進行IEDDA反應的寡核苷酸的凝膠內熒光成像，d）兩者凝膠內熒光成像的Merge
D：對應于修飾有ATTO 390的引物P2的凝膠內熒光成像
最后作者開始嘗試在細胞水平上將探針1和6摻入到DNA上實現雙重正交標記。首先通過設計細胞毒性試驗來確定后續代謝標記中使用的探針濃度，通過MTT實驗可知探針1和6的適宜濃度均為0.1 mM。接下來作者的想法是將探針1和6分別進行代謝標記，將各自代謝標記的實驗條件摸索清楚后，然后再繼續將兩探針同時進行代謝標記來實現兩者的正交標記。在將探針1進行代謝標記的實驗中，作者最初將細胞與探針1孵育48 h后用染料11進行標記，但并未觀察到染色后的DNA，這可能是由于探針1的代謝效率低或1-甲基環丙烯在染色質結構中的不可及性。隨后作者嘗試了兩種實驗方案的改進（① 在使用染料標記前用鹽酸鹽溶液對DNA進行變性，②針對細胞內核苷酸代謝途徑中將脫氧核糖核苷轉變為相對應的脫氧核糖核苷三磷酸較為關鍵，通過添加合成的核苷三磷酸轉運蛋白（SNPP）和探針10來提高代謝通量），結果細胞在探針10與SNTT的共同孵育下最后成功觀察到了標記的DNA（圖4A）。接著在嘗試探針6的代謝標記實驗中，作者將細胞與探針6孵育48 h后用鹽酸鹽溶液變性，接著與溶在乙腈中的染料13孵育1 h，然后在 405 nm下照射20分鐘，結果表明探針6可以利用光點擊反應進行代謝標記（圖4B）。
B：HeLa細胞在經過脫氧核糖核苷酸6的代謝標記后，與染料13發生光點擊反應后的激光共聚焦顯微成像
作者在摸索清楚各自代謝標記的實驗方案后，開始在體內DNA水平上實現兩者的雙重正交標記（圖5A），HeLa細胞與100 μM的探針6一同孵育48 h，隨后在含有10 μM的10和10 μM的SNTT的溶液中孵育10 min，隨后在培養基中孵育2小時后固定細胞。接著將細胞與1 μM的染料14（染料11的發射波長與染料13有重疊）過夜處理進行IEDDA反應。然后， DNA經鹽酸鹽溶液變性處理，接著將細胞與含有染料13（30 μM）的乙腈共同孵育，在405 nm下對細胞進行照射，以誘導光點擊標記。結果在兩個發射波長下，細胞核中存在沒有完全重疊的熒光（圖5B），這表明作者成功對基因組DNA進行雙重正交標記。
?B：在優化后的實驗條件下，在Hela細胞經過脫氧核糖核苷三磷酸10和脫氧核糖核苷酸6的雙重代謝標記后的激光共聚焦顯微成像
本文作者：WJ
原文引用：https://doi.org/10.1002/anie.202403044
