膽管癌（cholangiocarcinoma, CCA）又稱膽道癌，是一種高度異質性的膽道惡性腫瘤，約占原發性肝癌的15%和胃腸道惡性腫瘤的3%[1]。與大多數癌癥一樣，在?CCA?進展的復雜情況中，糖基化的改變，極大地影響了CCA的發生發展[2]。一些異常表達的聚糖和糖復合物（例如糖蛋白、糖脂）已被用作CCA診斷和預后預測的腫瘤標志物[3-5]。此外，某些獨特的聚糖修飾也與CCA患者的短期生存相關，并在CCA細胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥等過程中發揮關鍵作用[6-8]。因此，針對CCA糖基化的功能闡明受到了越來越多的關注。
O-連接β-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked β-N-acetyl-glucosamine,?O-GlcNAc），是一類特殊的單糖O-糖基化修飾，僅發生在細胞質、細胞核及線粒體蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，并且僅受單一的一對糖基轉移酶（O?GlcNAc transferase, OGT，催化O-GlcNAc糖基化）和糖基水解酶（O?GlcNAcase,?OGA，催化O-GlcNAc去糖基化）調控[9]。O-GlcNAc修飾的動態平衡對于維持細胞穩態至關重要，然而其在膽管癌進展中的機制還尚未清楚。目前針對O-GlcNAc修飾異常變化在膽管癌中的功能研究仍然有限，同時缺乏針對膽管癌系統性的蛋白質O-GlcNAc修飾的組學信息和機制探討。因此，本文中，我們圍繞O-GlcNAc修飾的異常改變在膽管癌細胞中的功能展開研究，對膽管癌及膽管上皮細胞中蛋白質O-GlcNAc修飾進行了大規模組學鑒定，同時，探討了O-GlcNAc修飾蛋白在膽管癌中的作用機制。
基于此，本課題組與國家蛋白質科學中心（北京）劉嘉琳副研究員、南京大學附屬鼓樓醫院消化內科王雷主任和南京大學化學化工學院馬晶教授合作。近日，在ACS Central Science期刊上報道了一項關于膽管癌的化學糖蛋白質組學鑒定及糖基化功能研究的工作。該項研究中，我們基于非天然糖代謝標記技術輔助的完整糖肽組學鑒定方法（即Click-iG策略），對膽管癌及膽管上皮細胞中O-GlcNAc修飾的完整糖肽進行了組學鑒定及差異分析（圖1），并關注到在膽管癌細胞中上調最為顯著的角蛋白18（keratin 18, K18）。
圖1. 基于Click-iG策略對膽管癌及膽管上皮細胞中蛋白質O-GlcNAc修飾的組學鑒定
接下來，我們進一步驗證了K18蛋白中Ser30位點為主要的O-GlcNAc修飾位點。接著，我們構建了K18敲低及重組過表達K18-WT或K18-S30A的膽管癌穩轉細胞株，并發現K18蛋白Ser30位點的O-GlcNAc修飾可能通過調控細胞周期檢查點的蛋白表達，并增強K18蛋白的穩定性，從而在體內外水平促進膽管癌的細胞增殖（圖2）。
圖2. K18?O-GlcNAc修飾促進膽管癌細胞的體內外生長
最后，我們對K18的相互作用蛋白組進行了鑒定，并發現K18 Ser30位點的O-GlcNAc修飾促進了K18與異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）的相互作用，可能進一步參與調節膽管癌細胞的三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循環（圖3）。
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圖3.?O-GlcNAc修飾促進K18-IDH相互作用并調節膽管癌細胞的TCA 循環
綜上，本研究利用化學糖蛋白組學Click-iG策略，對膽管癌體系的蛋白質O-GlcNAc修飾做了系統性的組學鑒定及分析，并揭示了K18蛋白Ser30位點的O-GlcNAc修飾可能通過促進K18-IDH的相互作用，進而調節膽管癌細胞的TCA循環，最終影響膽管癌的進展。這些發現為K18在膽管癌中的作用提供了新的機制見解，并提示了通過靶向K18?O-GlcNAc修飾治療膽管癌的策略的潛在價值。
該工作以“O-GlcNAcylation Facilitates the Interaction between Keratin 18 and Isocitrate Dehydrogenases and Potentially Influencing Cholangiocarcinoma Progression”為題發表在ACS Central Science期刊（DOI: 10.1021/acscentsci.4c00163）。南京大學化學化工學院謝然研究員、國家蛋白質科學中心（北京）劉嘉琳副研究員、南京大學附屬鼓樓醫院消化內科王雷主任和南京大學化學化工學院馬晶教授為該論文的通訊作者，本課題組博士生孟祥鳳為第一作者，南京大學附屬鼓樓醫院消化內科周悅為共一作者。
此項研究得到了南京大學配位化學國家重點實驗室及化學和生物醫藥創新研究院（ChemBIC）的重要支持，得到國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金、江蘇省高層次創業創新人才引進計劃（個人、團體）、中央高校基本科研業務專項資金、北京市自然科學基金等經費支持。特別感謝北京大學化學與分子工程學院陳興教授、北京大學藥學院成波助理研究員、國家蛋白質科學中心（北京）質譜平臺付斌老師等提供的技術指導或支持。
文章作者：MXF
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00163
責任編輯：LD
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