分享的是一篇發表在 Angewandte Chemie International Edition 上的文章，標題是“Site-Selective Construction of?N-Linked Glycopeptides through Photoredox Catalysis”，文章的通訊作者是來自上海交通大學的王平教授，他的課題組主要從事化學合成具有重要生理活性的糖蛋白和糖肽、糖類分子合成及其方法學研究以及多肽合成方法學研究。
蛋白質糖基化是一種重要的翻譯后修飾，對于宿主與病原體相互作用、調節免疫反應、促進蛋白質折疊和維持蛋白質的穩定性至關重要。在不同類型的聚糖中，N-聚糖是一種廣泛且保守的翻譯后修飾，存在于大多數細胞表面。N-聚糖在優化治療肽和蛋白質方面發揮著至關重要的作用。然而，由于使用當前的基因表達系統難以獲得同質糖蛋白，研究糖蛋白結構與功能之間的關系一直具有挑戰性，因為通過非模板化翻譯后糖基化生物合成的糖蛋白通常以難以分離的復雜混合物形式產生。
為了解決這個問題，人們已經開發了多種方法來化學組裝 N-連接的糖肽。除了在固相肽合成期間使用糖基氨基酸制備糖肽之外，Lansbury 及其同事開發的一種合成方法也被廣泛采用，該方法將中等大小的部分保護的肽與自由的糖基殘基和糖基胺結合以產生糖肽片段（方案 1A）。然而，這種方法有著偶聯產率低、糖胺易分解等缺點。而可見光氧化還原催化的最新進展帶來了新的合成手段。脫氫丙氨酸（Dha）是一種天然存在的非經典氨基酸，可以通過 β-消除來自絲氨酸（Ser）的羥基或來自半胱氨酸（Cys）的硫基來有效地摻入肽中。因此，修飾 Dha 是一種有吸引力的方法，可以高效地對肽和蛋白質進行位點選擇性修飾。目前已經開發了一系列針對 Dha 的肽的復雜光氧化還原方法，然而，通過光氧化還原催化合成 N-連接糖肽的潛力（增強不同 Dha 功能的重要策略）仍然沒有得到充分研究。
在這篇文章中，作者首次報道了 N-糖基草胺酸與含有 Dhas 的復雜肽的可見光介導的吉斯反應，通過后期修飾方法產生了 N-連接的糖肽（方案 1D）。該反應在溫和條件下表現出對各種肽功能團（例如酸、胺、醇和吲哚）的高垂直反應性。它促進了復雜肽（例如硫鏈菌素）的直接修飾，而使用之前的方法實現這一目標是十分困難的。此外，在胎牛血清存在下，用聚糖修飾的肽顯示出改善的抗腫瘤活性和穩定性。
方案 1 光氧化還原催化合成 N-連接糖肽的方法進展
肽的有效 N-糖基化需要在溫和的反應條件下進行位點選擇性和功能團相容性，以避免其他光不穩定殘基的干擾。因此作者認為在復雜肽環境中將糖基化氨甲氧自由基與 Dha 的位點選擇性吉斯加成是更好的選擇。
作者首先進行了含有 Dha 的模型肽的制備。經過大量實驗和反應條件的優化，在 35°C、藍色 LED 光（465 nm，40 W）下，進行肽?1?與作為自由基前體的 N-糖基草胺酸?2?的自由基偶聯。12 小時后，純化得到所需的 N-連接糖肽?5-a?和?5-b，為兩種非對映體的幾乎相等的混合物，LC-MS 產率為 71%，具有高位點選擇性（方案 2D，條目 1）。兩種非對映體（5-a?和?5-b）的結構通過合成標準糖肽得到了確認。而在沒有照射的情況下，未檢測到所需產物的痕跡（方案 2D，條目 5）。如方案 2F 所示，使用優化的光氧化還原條件，肽?1?與含有不同低聚糖基團的各種 N-糖基草胺酸反應。這些試劑可以很容易地從糖胺或糖基疊氮通過三步制備，產率很高。總的來說，可以優異的產率獲得含有單糖、雙糖和三聚糖的糖肽（6-14），而其中含有三糖基序的產物?14?的產率超過 84%。并且方案 2G 顯示，所選反應混合物的圖譜表明反應以高選擇性進行，僅產生微量的副產物。
方案 2 光氧化還原催化制備 N-連接糖肽的進展。
接著作者使用源自不同長度和組成的天然蛋白質的肽受體進一步探索了這種糖基化方法的范圍（方案 3A）。作者，含有 11-18 個氨基酸的?TIGIT（T30-S40，15）、SIGLEC-15（A166-A180，16）和 PD-1（L65-F82，17）與 N-糖基草胺酸?2?反應良好，在藍色 LED 照射下產生 N-糖基化肽（20-22），產率為 62%-85%。而中等大小的肽（22-34個殘基）在這種轉化中也表現良好。當用 N-糖基草胺酸?2?進行糖基化時，PD-L1（F211-A232，18）和 HSV-1 的 gD（R92-F125，19）產出了 N-糖肽（23?和?24），產率為 60%-68%。值得注意的是，化學合成的糖肽適合于酶促糖基化。如方案 3B 所示，使用糖基轉移酶 Endo-M N175Q 修飾糖基化肽 SIGLEC-15（A166-A180）片段?21?和 PD-L1（F211- A232）片段?23?以構建復合 N-糖肽。這些糖肽的兩種非對映體（21?和?23）與唾液酸化的糖基氧唑嗪反應，以優異的產率產生所需的復合糖肽（25?和?26）。
然后作者發現這種轉化對一系列生物活性肽和肽藥物均有效，例如特利加壓素（用于治療肝腎綜合征）、Lynronne-1（一種抗菌肽）和替加波肽（用于治療晚期激素難治性前列腺癌）（方案 4A）。所有這些生物活性肽都經過位點選擇性吉斯反應，產生所需的 N-糖肽（27-29），LC-MS 產率范圍為 64%-77%。并且值得注意的是，特利加壓素是一種具有一個二硫橋的環肽。這些例子表明，這種自由基介導的方法與所目標肽中的所有蛋白質原氨基酸（除自由半乳糖外）相容。而該反應的實用性在抗生素硫鏈菌素的后期功能化中得到了進一步證明。硫鏈菌素是一種由 26 個氨基酸組成的環形復雜肽，它合成的挑戰性和溶解性差限制了其在臨床中的使用。作者使用新的合成方法對 Dha?16?進行了糖基化，合成了?30，LC-MS 產率為 47%。通過核磁共振光譜法證實了修飾肽（30）的結構。
之后作者評估了修飾肽的生物活性，發現 Lynronne-1 在修飾后保留了顯著的抗菌功效，最低抑制濃度（MIC）為 8 μg/mL。并且有趣的是，Lynronne-1（28，L/D）的糖基化變體在胎牛血清中表現出了穩定性的增強，超出了作者最初的預期。同時，作者使用 MCF-7 乳腺癌細胞系評估了修飾后的替加波肽?29?的抗腫瘤活性。結果表明，與未修飾的替加波肽相比，糖基化形式的替加波肽表現出更好的抗腫瘤性能。
最后根據實驗結果和現有文獻，作者提出了該反應的可能機制（方案 5）。在藍色 LED 照射下，[IrⅢ]*（E1/2 red?[IrⅢ*/IrⅡ] = +1.21 V vs SCE in CH3CN）產生光激發。在銫存在下，草胺酸?31?被轉化為草酸鹽?32。草酸鹽?32?的氧化勢為 +1.17V，在逐步損失一分子 CO2 ?后，它可以被 [IrⅢ]* 氧化，通過單電子轉移（SET）形成氨甲氧自由基?33。隨后?33?與缺電子 Dha 殘基?34?之間發生吉斯反應產生自由基中間體?35，然后通過 [IrⅡ] 進行單電子還原形成負碳離子?36。隨后進行中間體?36?的質子化，得到所需的 N-連接糖肽?37。
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方案 5 提出的光催化偶聯加成反應機制
總而言之，作者開發了一種使用光氧化還原催化吉斯加成合成 N-連接糖肽的通用策略。與當前依賴于形成胺鍵的方法不同，該策略通過 N-糖基草胺酸與含有 Dha 的肽的偶聯來構建 N-連接的糖肽。這種方法條件溫和，可以在廣泛的肽中進行位點選擇性 N-糖基化。這有助于合成含有 Dha 的其他生物活性肽的 N-糖基化肽類似物。糖基化后觀察到的穩定性和活性的改善進一步證明了該策略的實用性。這種方法將為生物學和治療研究提供一種有價值的工具。
本文作者：JX
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https://doi.org/10.1002/anie.202415565
