介紹一篇發表在Nature Methods上的文章“Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging”，通訊作者是來自韓國浦項科技大學的Young-Tae Chang，韓國順天大學的Sung Ho Ryu，Hyung-Ho Ha和Do-Hyeon Kim。
熒光活細胞成像已成為研究蛋白質動態分子活動不可或缺的工具，尤其是單粒子跟蹤（single-particle tracking, SPT）技術，可以直接可視化工作中的蛋白質分子，提供它們在單分子水平上動態相互作用的時空信息。然而，目前活細胞單分子成像主要局限于短期時間尺度（低于幾十秒），這主要是由于熒光染料的光漂白，即熒光染料在激光照射下熒光信號逐漸淬滅。為解決這一問題，研究人員不斷嘗試開發光穩定的熒光染料以實現更穩定和長久的蛋白質分子動態成像。在本文中，作者開發了新型有機染料PF555，在活細胞成像中的光漂白壽命比以前已知的光穩定染料長一個數量級，為生理條件下單分子水平的長期活細胞成像提供了強大的工具。
作者開發新染料的思路來源于近期發現的一種有機染料光藍化現象，在激光激發下，大部分染料被漂白，但有一小部分染料會轉化為具有藍移激發和發射光譜的物質。作者先在細胞中表達了N端Halo標簽偶聯的EGFR，并用氯烷偶聯AF647（CA(O2)-AF647）標記；隨后用642 nm激光照射標記的細胞，直到AF647在遠紅色通道（654-870 nm）中完全光漂白，并產生由561 nm激光激發，572-624 nm范圍發射的藍移新生熒光。出乎意料的是，在光藍物種中，作者觀察到一種超光穩定的化合物。
為了純化這種光穩定物質并闡明化學結構，作者合成了大量的TSCy5 作為 AF647 的簡化相似化合物進行體外合成和純化，作者在自搭建裝置中使用了高激光功率和恒定的氧氣補充，并純化出高效液相色譜中的兩個候選峰，并表征確認后一個峰（保留時間20.05 分鐘，產量0.007%）是新的超級光穩定物種，其激發和發射峰值分別為555 nm和567 nm，作者將其命名為PF555（Phoenix Fluor 555）。
接下來，作者將氯烷烴 （chloroalkane, CA）基團引入 PF555生成CA（O2）-PF555來標記Halo標簽融合蛋白。顯微鏡下，PF555的光漂白壽命為314.4 秒，遠高于已有的光穩定染料，且在使用時不需要添加光漂白的拮抗劑。作者隨后用PF555觀測EGFR內吞和再循環過程，該過程持續了近1小時，可以看到相比于對照條件下EGFR的穩定信號，添加EGF后可以看到EGFR信號減弱發生內吞，并在EGF被洗滌后信號重新逐漸復原恢復到細胞表面。最后，作者還用該熒光分子可視化了單分子EGFR與活細胞中網格蛋白包被結構（clathrin-coated structures, CCS）相互作用的動態過程，結果表明EGFR通過與CCSs周圍的連接蛋白發生弱相互作用，來鑒別適合EGFR向細胞內運動時可“騎行”的CCSs結構。
總的來說，本文開發了一種用于活細胞成像的熒光染料，有超高的光穩定性，對研究蛋白質分子機制具有重大潛力。
本文作者：FTY
責任編輯：WYQ
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02584-0
文章引用：10.1038/s41592-024-02584-0
