化學合成法存在步驟多、收率低，需通過色譜純化來分離3Fax和3Feq異構體等缺陷。由醛縮酶介導的化學酶法也存在反應可逆、受熱力控制、需色譜純化異構體等不足。于是，作者提出通過聯用唾液酸醛縮酶與CMP-唾液酸合成酶來捕獲3Fax的動力學產物，并以60%的收率獲得了CMP-3FaxNeu5Ac(Scheme 1)。
化合物5在酸性條件下不能直接轉化成3，而是先生成7?(3Fax-Neu5Ac-2P)，然后經堿性磷酸酶?(ALP)催化獲得目標產物。為了量化F緩解5水解的程度，作者進行了基于MS 的動力學分析，分別將2和5水解成1和7，結果發現C3位置的F取代使水解速率降低了約100倍（圖1）。
隨后，作者在U937細胞測試3a，發現它能有效降低Siglec-1, -2, -3, -5, -7, -8和-15的唾液酸聚糖配體水平（圖2）。
接下來，作者檢驗動力學捕獲方法能否有效獲得5的衍生物。如Scheme 2所示，作者通過級聯酶法順利獲得兼具光交聯基團和點擊手柄的雙官能衍生物。相比之前的合成方法，該新型化學酶法，步驟少、產率高。
接下來，作者將光交聯探針11與三種人源重組的ST：ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4進行UV交聯測試。首先，作者使用11與三種高濃度 (500 μM) 的ST進行測試，觀察到11對ST6GAL1產生強的UV依賴性光交聯，對ST3GAL4有最弱的UV依賴性光交聯，且與ST3GAL1無光交聯。隨后，降低11的濃度，發現11對ST3GAL1有明顯的選擇性，甚至只需10 μM?11可實現與兩者的光交聯。當增加CMP-Neu5Ac (2) 的濃度時，11對ST6GAL1活性位點的特異性會被競爭性抑制（圖3）。
最后，作者評估了化合物11和5對ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4的抑制強度和親和力。結果表明，與5相比，11對ST6GAL1的抑制力稍有增加；對ST3GAL4有相似的抑制強度；對ST3GAL1缺乏抑制效力。另一面，11與ST3GAL1的結合較差，與ST6GAL1, ST3GAL4有相似的結合強度（圖4）。
總之，作者報告了一種快速、精準合成ST探針 (CMP-3FaxNeu5Ac) 的動力學方法，并且驗證了該方法可用于獲得C5, C9位置改造的探針，及其能實現不同ST間的選擇性交聯。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c10835
責任編輯：WXL
