分享一篇近期發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，題目是“On-Demand Thio-Succinimide Hydrolysis for the Assembly of Stable Protein–Protein Conjugates”。文章的通訊作者為英國(guó)劍橋大學(xué)化學(xué)學(xué)院Gon?alo J. L. Bernardes教授。
蛋白質(zhì)偶聯(lián)物通過將兩種天然蛋白質(zhì)結(jié)合成單一支架，在生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域扮演著日益重要的角色。傳統(tǒng)上，這些偶聯(lián)物主要通過融合蛋白的重組表達(dá)獲得，但這種方法存在一些限制，如N-C末端連接的限制、錯(cuò)誤折疊的風(fēng)險(xiǎn)、低表達(dá)量以及組成蛋白系統(tǒng)的不相容性，這些問題阻礙了共表達(dá)。作為一種替代策略，翻譯后蛋白偶聯(lián)技術(shù)允許獨(dú)立表達(dá)的蛋白質(zhì)在翻譯后連接，這種方式不僅克服了N-C末端偶聯(lián)的限制，增加了拓?fù)涠鄻有裕夷軌蛟诓煌乃拗髦挟a(chǎn)生不兼容的蛋白組分，使得一些難以通過傳統(tǒng)重組表達(dá)方式獲得的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物成為可能。這種翻譯后方法包括酶催化和基于標(biāo)簽的技術(shù)、非天然氨基酸與生物正交反應(yīng)的結(jié)合，以及異雙功能和同雙功能化學(xué)連接策略，其中后者因其簡(jiǎn)單的連接子合成和應(yīng)用廣泛而受到歡迎。
半胱氨酸殘基與馬來酰亞胺試劑的選擇性Michael加成反應(yīng)是生產(chǎn)蛋白-蛋白偶聯(lián)物相對(duì)可靠的反應(yīng)。然而，馬來酰亞胺的逆Michael解偶聯(lián)和隨后被內(nèi)源性硫醇捕獲導(dǎo)致所得偶聯(lián)物的降解，使得目前所使用的馬來酰亞胺試劑并不適用于產(chǎn)生穩(wěn)定可控的蛋白-蛋白偶聯(lián)物。作者認(rèn)為雙馬來酰亞胺試劑在制備穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物時(shí)，必須滿足三個(gè)關(guān)鍵條件：（1）其與硫醇的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)需要與第一代馬來酰亞胺保持一致；（2）硫代琥珀酰亞胺的開環(huán)水解應(yīng)在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)完成，以確保形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物；（3）未反應(yīng)的馬來酰亞胺應(yīng)最小程度或可控地開環(huán)水解為無反應(yīng)性的馬來酸。因此本研究開發(fā)了一種同源雙功能連接策略（圖1），以不易水解的馬來酰亞胺形式代替原本可以自水解的馬來酰亞胺，構(gòu)建復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，從而滿足第一和第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。在應(yīng)用外部觸發(fā)因素時(shí)，通過硫代琥珀酰亞胺的快速開環(huán)水解，所得偶聯(lián)物可以完全穩(wěn)定，從而滿足第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
研究首先確定了一種合適的自穩(wěn)定馬來酰亞胺來暫時(shí)抑制馬來酰亞胺水解，而僅在在施加外部刺激時(shí)觸發(fā)硫代琥珀酰亞胺水解。由于硫代琥珀酰亞胺附近的質(zhì)子化胺的感應(yīng)吸電子效應(yīng)是加速水解的主要驅(qū)動(dòng)力，因此考察了將氨基保護(hù)來暫時(shí)抑制水解。通過對(duì)馬來酰亞胺衍生物1，2，3（圖2）對(duì)比，得出對(duì)硫代琥珀酰亞胺附近的酰胺鍵的吸電子作用促進(jìn)水解，另一方面，羧基陰離子（馬來酰亞胺3）具有抑制水解的電子供體效應(yīng)，提高了馬來酰亞胺衍生物的穩(wěn)定性。
由于酰胺基團(tuán)是一種促進(jìn)水解的取代基，因此很明顯，消除其效應(yīng)是最小化預(yù)共軛水解的關(guān)鍵。為了解決這個(gè)問題，我們用氨基甲酸酯保護(hù)的仲胺合成了一種替代馬來酰亞胺衍生物，與馬來酰亞胺氮（馬來酰亞胺4）相距兩碳（圖3a）。在相同條件下，馬來酰亞胺?4?在?8?小時(shí)后水解率低于?10%（圖?3a）有了足夠穩(wěn)定的馬來酰亞胺，我們假設(shè)馬來酰亞胺?4?的衍生物可以使用不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)暫時(shí)掩蓋。使用生物偶聯(lián)相容的觸發(fā)器，設(shè)想可以隨后去除氨基甲酸酯，從而揭示出一個(gè)吸電子的仲胺基團(tuán)。為了探索這一點(diǎn)，合成了馬來酰亞胺?5、6?和?7，分別具有化學(xué)、光化學(xué)和酶促脫保護(hù)觸發(fā)器。發(fā)現(xiàn)所有三個(gè)氨基甲酸酯基團(tuán)都賦予馬來酰亞胺與4一致的穩(wěn)定性，在相同條件下（pH 7.0，NaP我，20mM，25°C）（圖3a）。馬來酰亞胺5–7與含半胱氨酸的五肽（Ac-LVCAF-NH2）進(jìn)行反應(yīng)，并通過HPLC-MS評(píng)估胺脫保護(hù)和硫代琥珀酰亞胺水解率。實(shí)驗(yàn)中，源自馬來酰亞胺5的肽基-硫代-琥珀酰亞胺含有一個(gè)二硫鍵，在加入TCEP后，通過硫醇酯環(huán)化啟動(dòng)胺脫保護(hù)（圖3 b）。進(jìn)一步由5和6衍生合成了同源雙功能的雙馬來酰亞胺試劑(圖3 c)。
本文選擇了PD-L1和HER2作為與插入在C端區(qū)域的游離半胱氨酸殘基反應(yīng)形成同源（圖4 a, b）和異源（圖4 c）二聚化方案的模型蛋白，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)合產(chǎn)生的二聚體的功能大于其組成部分。
同時(shí)，三聚及四聚體的組裝也被證實(shí)是有效的（圖5 a）。其次，基于光催化脫保護(hù)的馬來酰亞胺?6?的同型雙功能連接子通過組裝得到穩(wěn)定的?IgG/sdAb?抗?HER2/PD-L1?雙特異性構(gòu)建體進(jìn)一步證明了適用性（圖5 b）。
綜上所示，按需水解馬來酰亞胺提供了一種強(qiáng)大的化學(xué)驅(qū)動(dòng)翻譯后蛋白-蛋白偶聯(lián)方法，既克服了蛋白-蛋白偶聯(lián)問題，又能完全控制馬來酰亞胺和硫代琥珀酰亞胺的穩(wěn)定性。雙馬來酰亞胺試劑在合成穩(wěn)定的蛋白-蛋白偶聯(lián)物中有很大的潛力。
原文鏈接：https://testpubschina.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03721
