分享一篇發表在Nat.?Chem. Biol.上的文章，題目為“A de novo designed coiled coil-based switch regulates the microtubule motor kinesin-1”。通訊作者為布里斯托大學的Derek N. Woolfson, Mark P. Dodding和Jessica A. Cross。其中，Woolfson教授的研究方向為蛋白質折疊及蛋白設計。
設計具有構象開關功能的蛋白是具有挑戰的。例如，從頭設計的蛋白通常具有極端穩定的結構，往往不像天然蛋白一樣具有構象間轉換的動態能力。另一方面，蛋白的構象轉換在細胞骨架運動蛋白中尤為重要，例如，kinesin-1是一種以異四聚體形式存在的微管馬達，當無貨物結合時，其處于一種自抑制構象。最近，作者團隊解析了kinesin-1自抑制構象的結構，結果揭示了蛋白兩個CC結構域間存在的柔性鉸鏈結構，即肘狀結構（elbow），該區域對復合體從折疊（λ）構象到打開構象之間的轉變至關重要。本文中，作者嘗試通過從頭設計方法在該結構域處引入構象開關，從而實現對kinesin-1構象的靈活控制。
為了實現這一目的，作者計劃向蛋白的CC2/CC3結構域間引入重新設計的elbow結構域（pA），它可以與從頭設計的多肽配體（pB）結合，從而發生構象轉變。作者首先用AlphaFold2預測了野生型kinesin的結構，結果顯示AF2能夠可靠地捕捉到kinesin WT的兩態平衡。而對于kinesinΔElbow，AF2則給出完全打開的構象。這些預測都通過體積排阻色譜（SEC）實驗得到了驗證。
接下來，作者嘗試通過從頭設計elbow結構域實現對kinesin構象的靜態控制。作者利用其此前開發的可視化卷曲螺旋結構域的軟件Socket2，分析了kinesin在λ構象時elbow結構域中存在的卷曲螺旋、螺旋間和凹凸（knobs-into-holes）相互作用。結果提示其中5個殘基的去除可有效地破壞elbow結構域的構象靈活性。AF2預測和SEC實驗都證實了這種變體（Elbow Lock）被鎖定在λ構象。隨后，作者也成功用從頭設計的elbow結構域（EL-CC-Di-IR）將蛋白鎖定在開放構象。
基于上述成功的改造結果，作者嘗試向elbow結構域中引入構象開關。作者選擇了一種從頭設計的的異源二聚體，其中兩個單體分別記為pA和pB，二者的結合將形成穩定的反平行卷曲螺旋結構。通過精細調整pA在elbow結構域處的插入位置，作者成功設計了模擬天然kinesin的工程化蛋白EL-pA-Ala。同樣地，AF2預測和SEC實驗共同顯示當EL-pA-Ala與pB結合時將發生從λ構象到開放構象的完全轉變。作為直接的生物物理證據，作者通過小角X射線散射（SAXS）準確地表征了SEC實驗中所提示的結構。
最后，作者在活細胞內測試了這種從頭設計肽誘導的構象轉換是否能實現對kinesin的變構激活。成像結果顯示，處于λ構象的熒光標記kinesin在胞質內彌散分布，而處于開放構象的kinesin則具有微管定位。重要的是，在具有穿膜能力的肽pB處理下，EL-pA-Ala的亞細胞定位發生了顯著改變，提示其在細胞內的變構激活。
本文作者：TYC
責任編輯：ZF
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01640-2
文章引用：DOI: 10.1038/s41589-024-01640-2
