研究蛋白質相互作用（PPI）對于揭示靶蛋白的功能以及系統性地理解相關生物過程至關重要。傳統的PPI研究方法如親和質譜，需要裂解細胞，從而分離和鑒定互作蛋白。然而裂解細胞會干擾蛋白的亞細胞分布并稀釋蛋白，可能會導致一些結合蛋白分離或者產生一些非天然的蛋白相互作用。而基因編碼的具有潛在生物反應性的非天然氨基酸（Uaa）能夠原位捕獲活細胞中直接相互作用的蛋白質，并且通過鑒定Uaa介導的交聯肽段來確定相互作用界面。但是由于蛋白樣品的復雜性以及交聯肽段較低的離子化效率，鑒定Uaa介導的交聯肽段仍舊很有挑戰性。即使肽段水平富集顯著增加了檢測的靈敏度，但是仍存在交聯效率較低的問題，導致被鑒定的交聯肽數量較少。后來，人們開發出了可富集的具有潛在生物反應性的Uaa EB3，并在活細胞模型蛋白中成功驗證，但是這種Uaa只能與蛋白組中豐度較低的半胱氨酸反應，仍然無法很好地滿足需求。最終，具有多種氨基酸反應性、交聯效率較高并且可富集的氟硫酸鹽-L-酪氨酸（FSY）被開發出來，這種Uaa對Lys、His以及Tyr側鏈基團都具有反應性，在體外和活細胞中都具有很高的交聯效率，但是FSY的脫靶效應和交聯產物還沒有經過質譜驗證。
基于上述背景，作者在FSY的基礎上，結合了MS可裂解小分子交聯劑以及化學裂解交聯Uaa的特點，設計出了一種從未被報道過的MS可裂解化學交聯Uaa（MSCXUaa）。MSCXUaa具有以下優點：首先，與小分子交聯劑相比，MSCXUaa可以進入活細胞中在生理條件下原位交聯，而不用殺死細胞，能夠避免對原有蛋白相互作用的干擾。其次，相較于化學裂解的光交聯Uaa，MSCXUaa能夠在一級質譜中保持交聯肽段的完整性，增加交聯肽段鑒定的特異性。最后，質譜可裂解的交聯肽段相較于不可裂解的交聯肽段具有更高的離子化效率，可以在二級質譜中產生更多包含交聯位點的碎片離子，進而提高交聯肽段的碎片離子覆蓋率。
作者首先嘗試通過遺傳密碼子拓展技術在大腸桿菌中表達基因編碼的MSCXUaa。作者通過五步合成得到了MSCXUaa并命名為eFSY（如圖1a所示），并將氨酰tRNA合成酶chPheRS-1的氨基酸結合口袋進行了改造以匹配eFSY的結合。作者將190位含有TAG密碼子的帶有His標簽的EGFP與chPheRS-1的不同突變體共表達，然后通過His標簽純化結合凝膠電泳以及高分辨電噴霧電離飛行時間質譜分析篩選出了能夠識別eFSY的突變體（V393G，F464C），并命名為eFSYRS。為了驗證eFSY的成功插入，作者將24位為TAG密碼子的帶有MBP與His標簽的Z蛋白與eFSYRS在DH10B中共表達，并通過完整蛋白質譜以及Glu-C酶切肽段串級質譜分析證實eFSY成功插入到了MBP-Z的24號位點（如圖1b-f所示）。
已知FSY能夠與His、Tyr以及Lys側鏈基團交聯，為了測試eFSY的交聯能力，作者將MBP-Z（E24eFSY）與不同親和突變體（7Ala，7Lys，7His，7Tyr）共孵育。WB和串級質譜證明了eFSY能夠與His、Tyr和Lys產生交聯。通過在eFSY位點引入生物素標簽并用單親和微球進行富集，交聯肽段的富集度增加了十倍，驗證了eFSY可富集的特點（如圖1g-l所示）。
作者在分析質譜數據時發現eFSY與His、Lys產生的交聯是質譜可裂解的，與Tyr產生的交聯是質譜不可裂解的，而在可裂解的交聯中還包括交聯鍵斷裂與交聯基團內部碎裂兩種碎裂模式（如圖2f-i，3a-b所示）。由于目前沒有能夠完美分析這種交聯質譜數據的軟件，作者開發出了一個能夠考慮到文中所有形式的碎片離子的搜索引擎AixUaa。AixUaa運行的基本邏輯如圖3c所示。為了評估AixUaa鑒定Uaa介導的MS可裂解的交聯質譜數據的能力，作者構建了四個模擬的U-H/K交聯數據庫Sim1-4，并將AixUaa與現有搜索引擎進行對比，結果表明相較于現有的數據庫搜索引擎，AixUaa展示出了更高的鑒定精度。作者又將AixUaa用于分析硫氧化還原蛋白富集樣品，如圖3d-e所示，AixUaa鑒定出了更多的U-H/K交聯位點，總的交聯肽段鑒定數為391，對應184個蛋白。從圖3f中可以看出，鑒定到的交聯位點主要為Lys，這可能與Lys在細胞中的較高豐度有關。
?原文引用：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49517-1
責任編輯：LD
