分享一篇2023年發表在Nature Communications上的文章，題目是“Two-photon fluorescence imaging and specifically biosensing of norepinephrine on a 100-ms timescale”。文章的通訊作者為華東師范大學化學與分子工程學院化學系田陽教授。
神經遞質在維持生理過程方面起著至關重要的作用，例如調節新陳代謝，參與神經調控和影響器官功能。特別是，當神經遞質從突觸前膜釋放，通過突觸擴散到鄰近神經元，并與突觸后神經元膜上的受體結合時，神經元之間的信號傳導就會發生。例如，多巴胺（DA），腎上腺素（EP）和去甲腎上腺素（NE）是一類基于兒茶酚胺的結構相似且可相互轉化的神經遞質，其中NE在其相互轉化過程中處于中心位置。因此，NE被認為是脊椎動物中樞神經系統中的關鍵神經遞質之一，去甲腎上腺素能傳遞的功能障礙與一系列神經退行性和精神疾病密切相關，包括帕金森病（PD）、阿爾茨海默病（AD）、抑郁癥等。盡管它在各種生理和病理生理過程中的重要性得到公認，但以高靈敏度和高時空分辨率監測生命系統中的瞬態NE動力學仍然是一個艱巨的挑戰。
在此，設計并合成了一種新型小分子熒光探針（BPS3，圖?1），帶有兩個由烷基鏈連接的苯基吡啶，不僅保證了良好的水溶性和靈活的分子構象，而且還表現出優異的細胞膜靶向性。?此外，引入末端S-對甲苯硫代碳酸酯作為NE的觸發基團，可以進行順序親核取代，然后分別與NE的特征伯氨基和β-羥基發生環化反應，實現了優異的選擇性?向?NE?而不是其他兩種兒茶酚胺神經遞質（EP?和?AD）。
在添加NE的情況下，在緩沖溶液中對探針BPS3進行熒光滴定實驗。?如圖?2a?所示，隨著?NE?的逐漸加入，探針在?480nm?處的熒光強度相應降低，幾乎達到加入?300nM NE?時的最小值（約初始值的?23%）。?圖?2b?繪制了熒光強度變化率（ΔF/F0）與?NE?濃度的關系圖，在?0-200nM?的濃度范圍內表現出良好的線性，檢測限評估為?0.5nM（3σ/S，其中?σ為探針樣品的標準偏差（S.D.），n?=?20，S為校準曲線的斜率）。值得注意的是，即使對于通常與?NE?無法區分的兒茶酚胺神經遞質，即?DA?和?EP，它們的干擾也可以忽略不計（與目標分析物?NE?相比，DA?為?4.1%，EP?為?8.6%，圖?2c），?驗證了?BPS3?對?NE?的卓越選擇性。
圖3a顯示了5 μM探針BPS3在水溶液中與100 nMNE反應獲得的動力學數據，其中探針在480 nm處的熒光強度在與NE混合后立即降低，并在100 ms內達到平臺（綠色曲線）。如圖?3b?所示，在來自硼苯基的質子?H1,2?和來自硫代碳酸酯苯基部分的質子H11,13?之間發現了一對?NOE?信號，證實了兩個末端基團的空間接近性，這是折疊的典型特征?構象。?此外，對探針BPS3不同構象的理論計算也證實，折疊構象比拉伸或準正交構象具有相對較低的能量。?折疊構象的更高穩定性可以通過基于?Hirshfeld?分區?(IGMH)?分析的獨立梯度模型進一步合理化（圖?3c），它顯示出明顯的范德瓦爾斯相互作用和苯環之間的?π-π?堆積效應（綠色層狀）?在拉伸結構中未發現的區域）。?此外，與拉伸構象相比，BPS3的硫代碳在折疊構象中具有更大的Hirshfeld電荷值（圖3d），表明其具有更強的親電性，更有利于親核取代反應。
如上所述，探針BPS3可以在100 ms內完成水溶液中NE的檢測。然而，如果通過與二甲基甲酰胺（DMF）混合將系統中的水餾分降低到50%，則需要大約120秒才能完成與NE的反應（圖4a，紫色曲線）。為簡潔起見，將水中涉及BPS3-F的反應途徑稱為路徑1，將涉及BPS3-S的反應途徑稱為路徑2。如圖（圖4b），過渡態的理論研究表明存在漸進和級聯的親核取代-環化途徑。在兩條路徑（路徑?1?和路徑?2）中，在水性環境中觀察到涉及?BPS3、NE?片段和水分子之間各向異性氫鍵的反應坐標，其中活性水分子充當質子轉移的分子橋?通過分子間六元環過渡態的形成（路徑?1?中的狀態?TS6?和路徑?2?中的狀態?TS3，在圖?4c?中）。
如圖?5a?所示，BPS3?和?DiI?的兩個發射通道的熒光分布重疊良好，Pearson?相關系數高達?0.93，表明其在神經元細胞膜靶向方面具有出色的能力。如圖?5b?所示，最初，兩組神經元在神經元細胞膜處均表現出強烈的熒光發射。然而，當一組僅用PBS緩沖液處理，而另一組用高濃度鉀處理時，兩組的熒光強度差異很大，即前者的熒光強度幾乎保持不變，而后者的熒光強度變化很大?在?2s?內顯著增加，表明該組神經元細胞膜上的?NE?快速增加（圖?5c）。細胞內鈣濃度的增加進一步導致含有?NE?的囊泡遷移和融合到細胞膜，在那里它們最終被胞吐到突觸間隙中（圖?5d）
綜上所述，本文開發了一種新型雙光子激發小分子熒光探針?BPS3，它能夠在單個活神經元水平上實時監測和成像去甲腎上腺素，具有高選擇性和靈敏度，源自特定的順序親核取代環化觸發?反應。?更重要的是，這種開發的探針可以精確靶向神經元細胞膜，細胞膜是突觸的前沿細胞器，直接參與神經遞質的分泌和攝取，在神經信號的傳遞中起著極其重要的作用。?該探針最顯著的特點是令人印象深刻的高時間分辨率，可以在?100ms?內響應?NE，這是迄今為止報道的?NE?小分子熒光探針中檢測速度最快的。?基于綜合實驗和理論分析，揭示了一種獨特的雙重加速機制，即分子構象折疊和水橋接，顯著降低了探針與NE之間反應的活化能，從而提高了反應速率更多?分別是?105?倍和?103?倍。?得益于探針出色的時空分辨率，成功地將其應用于神經元?NE?反應及其在高鉀刺激下的動態成像，首次在秒級時間尺度上捕捉到神經元細胞膜上?NE?濃度的快速升高?小分子熒光探針。?更重要的是，腦組織切片的影像學研究進一步顯示?AD?小鼠的?NE?水平下調，這可能是由于?AD?病理下神經元的去甲腎上腺素能功能受損。?此處展示的結果不僅為?NE?檢測提供了一種優越的分子成像工具，有利于高級神經科學研究，而且還揭示了雙重加速機制，可能進一步為生物、分析、有機和物理化學家在研究中帶來新的靈感。?超快檢測和反應動力學規定。
