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為大家推薦一篇發表在Analytical Chemistry上的文章，文章標題是“mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation”。文章通訊作者是來自國家蛋白質科學中心的Chenxi Jia教授和Cheng Chang教授，以及威斯康星大學的Lingjun Li教授。Chenxi Jia教授課題組專注于神經肽組學和蛋白質組學方面的研究，Cheng Chang教授課題組主要從事質譜數據分析算法的設計與開發，而Lingjun Li教授課題組致力于生物分析科學和質譜相關技術的開發。本文中，作者設計并建立了一種基于同位素標記和靶向蛋白質組學技術的精氨酸二甲基化修飾鑒定策略，成功實現了二甲基化精氨酸位點的鑒定與生物學功能的表征。

精氨酸上的甲基化修飾是真核生物中廣泛且相對保守的蛋白質翻譯后修飾。這種修飾與多種細胞生物學過程，如RNA加工、DNA修復等，密切相關。這些修飾主要由蛋白質精氨酸甲基轉移酶（PRMTs）家族成員催化生成。具體來說，PRMTs將甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）轉移到精氨酸的胍基上。鑒于其在多種生物學過程及疾病發生發展過程中的重要性，開發一種能夠表征二甲基化精氨酸的策略是具有重要意義的。此前研究者針對這一修飾開發了一系列表征策略，但由于無法實現有效親和富集，也受限于該修飾較低的豐度，以及檢測技術的較高的假陽性率，因而無法對其有效的表征。

為了解決這一問題，本文中，作者設計并建立了mNeuCode策略。首先，研究者設計了mNeuCode標簽，來對修飾位點進行定位。基于此前研究，二甲基化精氨酸上的甲基基團來自于甲硫氨酸。因此，他們選用了6×氘代和2×13C+4×15N兩種同位素取代的甲硫氨酸進行短期培養，由此實現修飾位點二甲基化修飾的同位素標記。由于這兩種同位素取代存在質量差（△m=0.043 Da），通過高精度質譜檢測，研究者則可對這兩種修飾進行鑒定與區分。這43 mDa的質量差，則被認為是該方法mNeuCode的“簽名”。隨后，他們開發了NeuCodeFinfer算法，對其中數據進行處理，流程如下：（1）使用PANDA的峰值檢測算法來檢測質譜中的所有單同位素峰；（2）將所有單同位素峰在3-30 mDa窗口內進行配對，生成伴侶峰的候選列表；（3）將成對的單同位素組裝成同位素簇，每個簇中至少含有3個同位素峰；（4）導出數據，用于后續分析。基于此，他們可以先通過一次檢測，找到符合NeuCode的峰簇，再對同一組樣品進行一次PRM的靶向檢測。最終，結果顯示，他們在得到較高覆蓋度的情況下，鑒定到了70種蛋白上的176種二甲基化精氨酸位點。其中，有38%的位點是首次被鑒定到的。

最后，為了鑒定結果的可信度，他們對鑒定到的潛在攜帶二甲基化精氨酸的蛋白進行驗證。之前的報道中指出，FAM98A可能是精氨酸的二甲基化酶PRMT1的底物，但是沒有具體修飾信息。本文中，作者發現FAM98A上存在5個二甲基化精氨酸位點。他們將FAM98A敲低后，回補了野生型或其修飾位點的突變體。結果顯示，只有野生型的FAM98A能夠回補其在細胞遷移過程中的功能。由此證明了其在FAM98A上鑒定到的二甲基化精氨酸位點的真實性，以及技術的可靠性。

綜上，本文中，作者設計并建立了基于同位素標記和靶向蛋白質組學技術的mNeuCode技術，成功鑒定和表征了細胞中的二甲基化精氨酸的位點。對于二甲基化精氨酸相關疾病與生物學過程的研究來說，具有重要的意義。

本文作者：KLH

責任編輯：ZJ

文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.2c04648

原文引用：DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04648

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