反相色譜法是以被測的高分子為固定相、以惰性氣體為流動相，為了測定需要，在流動相中加入一些探針分子，它們是揮發性的低分子。
反相色譜法的作用
近十年來，高效液相色譜在蛋白質分離純化方面取得了很大的進展，并得到了廣泛的應用。HPLC包括排阻色譜、離子交換色譜、親和色譜以及反相色譜等，幾乎已在蛋白質分離中得到應用。這些方法在蛋白質分離中各有其地位，但到目前為止人們普遍認為反相高效液相色譜是分離純化蛋白質的最有效的方法之一。
反相色譜法的影響因素
1、溶質的分子結構（極性）
極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。同系物碳數越多，極性越弱，k越大；引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。
2、固定相
鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質的k越大。
3、流動相
極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的k越大；溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑；溶劑比例：水的比例增加，使k增大。
化學慧定制合成事業部摘錄
