近年來，綠色、可持續的皮克林界面生物催化（Pickering interface biocatalysis，PIB）技術已成為級聯生物轉化的研究熱點，這一技術通常利用不同載體將酶固定在Pickering乳液界面，從而實以疏水化合物為底物的界面生物催化。此外，具有兩親性的酶-聚合物綴合物（enzyme-polymer conjugates）也可直接作為乳化劑制備Pickering乳液，它們既起到穩定乳液作用，也能在界面上實現較高的催化效率。但是利用傳統方法制備酶-聚合物時，其偶聯位點存在非特異性和不可控性等問題，這會導致酶功能受損，影響酶的催化活性。另外，在構建級聯生物催化時，多種酶的體內表達純化也使得整個過程費時費力。為了克服上述問題，上?？萍即髮W李健與南丹麥大學吳昌柱課題組進行合作，實現了精準位點的酶-聚合物的可控制備，同時利用無細胞系統實現了不同酶的快速表達與級聯催化途徑的構建，為高值化學品的綠色合成提供了新方法。
研究人員選取苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）為骨架酶蛋白，聚苯乙烯（polystyrene，PS）為高分子聚合物，以此二者做為材料制備酶-聚合物綴合物，并與無細胞表達體系結合制備乳液，進行界面的級聯生物催化（圖1）。這一過程由三步方案來實現，首先，利用E. coli表達并純化BAL蛋白的突變體（BAL_A2B），即在其2號氨基酸位點引入非天然氨基酸（BibaF，B），做為與PS耦合的誘發位點。其次，通過原子轉移自由基聚合反應（ATRP）將PS與BAL在BibaF位點進行耦合。最后，在最適的反應條件下，利用酶-聚合物（BAL_A2B-PS）與無細胞表達體系混合制備Pickering乳液，實現界面的級聯生物轉化。
圖1 基于酶-聚合物的Pickering乳液制備過程示意圖及級聯生物催化反應。
研究人員首先對蛋白突變體BAL_A2B進行了表征（圖2），結果顯示，非天然氨基酸BibaF能夠成功插入BAL，并保留了超過82%的野生型酶的活性，這為后續ATRP聚合反應制備酶-聚合物綴合物奠定了基礎。
圖2 蛋白突變體BAL_A2B的表達、鑒定與活力測定
然后，作者以BAL_A2B為骨架蛋白，制備出三種不同的BAL_A2B-PS綴合物，并對其進行了結構表征與活力檢測（圖3）。結果表明，BAL_A2B與PS耦合成功，并很好地維持了蛋白質的二級結構。BAL_A2B-PS由于其側鏈聚合物的疏水作用，導致綴合物有一定程度的聚集，間接驗證了BAL_A2B與PS的成功耦合。酶活檢測表明所有三種BAL_A2B-PS綴合物都保留了較高的催化活性，這為后續的界面催化提供了可能。
圖3 BAL_A2B-PS綴合物的結構表征及活力測定?
隨后，作者利用BAL_A2B-PS制備Pickering乳液，并對其催化性能進行了檢測（圖4）。結果表明，以BAL_A2B-PS為乳化劑可制備出穩定的水包油型乳液，且乳液具備良好的、穩定的界面催化活性。結果顯示，酶-聚合物在液滴（droplet）表面的覆蓋率越高，越有利于Pickering界面催化。因此，作者選擇了BAL_A2B-PS200、水油比（w/o）比為5:5、綴合物濃度為50 μM時制備的乳液進行后續酶促級聯反應。
圖4 基于BAL_A2B-PS制備乳液的結構及性能表征
最后，作者將無細胞蛋白表達體系引入乳液水相，并對無細胞體系在乳液中的表達能力進行了表征（圖5）。結果顯示，該體系可對不同酶進行快速表達，這些酶無需純化，即可原位與乳液界面上的BAL酶進行級聯催化，可將級聯反應效率整體提升5倍以上，實現了目標產物的高效合成。
綜上，本研究構建的體系具有以下主要優勢，一是克服了傳統方法制備酶-聚合物時對酶活的損害，而在酶特定位點的精準耦合能夠最大程度地保護酶活性；二是無需對酶進行體內表達與純化，所采用的無細胞蛋白表達體系可以靈活快速地按需合成目的酶，實現原位級聯催化；三是體系綜合了PIB界面催化、蛋白精準修飾和無細胞表達等技術優勢，為構建高效的生物級聯轉化用于合成高價值化合物提供了新思路。
上述研究成果近日發表于Angewandte Chemie International Edition，上海科技大學物質學院博士研究生盧皓凡為論文第一作者，上?？萍即髮W李健教授和南丹麥大學吳昌柱教授為論文共同通訊作者，上?？萍即髮W為第一完成單位。
論文信息：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202312906??
Enzyme–Polymer-Conjugate-Based Pickering Emulsions for Cell-Free Expression and?Cascade Biotransformation;?Haofan Lu, Jingping Ouyang, Wan-Qiu Liu, Changzhu Wu*,?Jian Li*;?Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202312906
